Tế Bào Trong Bình Nuôi Cấy Tế Bào Nhiều Tầng Được Thu Hoạch Như Thế Nào?

Các bước để thu hoạch tế bào trong bình nuôi cấy tế bào nhiều tầng

1. Loại bỏ môi trường nuôi cấy.

2. Rửa sạch lớp tế bào đơn.

a. Thêm thể tích khuyến nghị (40 đến 50 mL mỗi lớp) CMF-PBS vào buồng. Đậy nắp chặt và phân phối CMF-PBS đều vào mỗi lớp buồng bằng cách đặt buồng nằm nghiêng về phía dài nhất.

b. Khi chất lỏng đã cân bằng, dựng đứng bình để tách các lớp, sau đó từ từ đặt buồng xuống vị trí ủ. Nghiêng buồng qua lại theo cả hai hướng để rửa sạch kỹ lưỡng từng lớp và loại bỏ toàn bộ môi trường cũ.

c. Lấy ra và loại bỏ dung dịch rửa. Khuyến nghị rửa lần thứ hai bằng CMF-PBS đối với các tế bào khó thu hoạch.

3. Tách lớp đơn.

a. Thêm thể tích khuyến nghị (20 đến 30 mL mỗi lớp) dung dịch tách đã được làm ấm trước vào buồng và phân phối đều cho mỗi buồng bằng cách làm theo các bước rửa. Làm ấm trước dung dịch tách sẽ làm giảm thời gian tiếp xúc cần thiết.

b. Gõ nhẹ vào thành buồng có thể giúp tách tế bào khỏi bề mặt.

4. Nghiêng nhẹ buồng sang hai bên và từ đầu này sang đầu kia để phân phối đều dung dịch tách trên mỗi lớp. Gõ nhẹ vào thành buồng có thể giúp tách tế bào khỏi bề mặt.

Khuyến nghị: Nên nuôi cùng một tế bào trong điều kiện giống hệt nhau (mật độ tế bào và lượng môi trường tương đối) trong bình nuôi cấy đối chứng, vì không thể theo dõi trực tiếp tác động của dung dịch tách lên các tế bào trong buồng. Sau đó, bình nuôi cấy đối chứng này (thường là bình hoặc buồng 1 lớp) có thể được xử lý song song để theo dõi cả sự phát triển của tế bào và tiến trình của quy trình thu hoạch tế bào.

5. Thu thập dung dịch tách chứa các tế bào được tái huyền phù trong ống ly tâm hoặc chai đựng bằng nhựa hoặc thủy tinh. Trung hòa chất tách (nếu có thể) và đặt các tế bào vào đá. Để thu hồi thêm các tế bào tách rời còn sót lại trong buồng, nên rửa thêm một hoặc nhiều lần:

a. Để dễ dàng loại bỏ các tế bào, bước rửa này có thể được thực hiện bằng CMF-PBS hoặc môi trường, sau đó được thêm vào huyền phù tế bào từ lần tách đầu tiên.

• Nếu thấy một số lượng lớn các tế bào sống trong dung dịch rửa, thì nên rửa lần thứ hai hoặc có thể cần điều chỉnh dung dịch tách hoặc quy trình thu hoạch. (Xem bước b bên dưới.)
• Nếu dung dịch rửa chứa ít tế bào sống, thì có thể bỏ qua bước này.

b. Đối với các tế bào rất khó loại bỏ, nên rửa bằng dung dịch tách được làm ấm trước. Có thể cần ủ tế bào trong vài phút để dung dịch có thời gian tác động lên các tế bào còn bám dính.

• Nếu thấy một số lượng lớn tế bào sống trong lần thu hoạch thứ hai, thì có thể cần điều chỉnh dung dịch tách hoặc quy trình thu hoạch ban đầu.
• Nếu lần thu hoạch thứ hai chứa ít tế bào sống, thì có thể bỏ qua bước này.

6. Vô hiệu hóa hoặc loại bỏ các tác nhân phân ly.

• Một số tác nhân phân ly nên được loại bỏ ngay lập tức bằng cách ly tâm để ngăn ngừa sự kéo theo có thể gây ra tình trạng bám dính tế bào kém hoặc độc tính, đặc biệt là khi kết hợp với môi trường không có huyết thanh.
• Tuy nhiên, các tác nhân phân ly khác, chẳng hạn như trypsin, có thể bị vô hiệu hóa bằng cách thêm môi trường lạnh có huyết thanh hoặc chất ức chế trypsin và không cần phải loại bỏ.
• Nếu muốn loại bỏ, hãy ly tâm hỗn dịch tế bào ở tốc độ 100 x g trong 5 phút. Sau đó, loại bỏ môi trường chứa tác nhân phân ly và thay thế bằng môi trường mới.

7. Đếm các tế bào để xác định sản lượng và khả năng sống của tế bào.