Do đó, việc kiểm soát chất lượng nồng độ, độ tinh sạch và tính toàn vẹn của nucleic acid cần được kiểm soát một cách chặc chẽ nhằm hạn chế tối đa các sự cố có thể xảy ra. Máy đo quang phổ vi thể tích (micro-volume spectrophotometer) tích hợp hệ thống điện di mao quản (capillary electrophoresis system) có thể được xem như giải pháp tối ưu trong kiểm soát chất lượng mẫu nucleic acid.
Kiểm soát chất lượng nucleic acid gần như là nền tảng cho các thử nghiệm sinh học phân tử.
Chất lượng nucleic acid ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng thành công của các thí nghiệm tiếp theo. Mẫu nucleic acid có nồng độ cao, độ tinh sạch cao và toàn vẹn, là một điều kiện tuyệt vời cho các nghiên cứu liên quan tới sinh học phân tử. Để có thể dễ hình dung, điều gì xảy ra khi đoạn gen bạn cần khuếch đại bị đứt gãy, liệu phản ứng có thể thực hiện được khi nồng độ DNA template quá ít. Phản ứng PCR có thể thực hiện được không khi mẫu chứa quá nhiều dư lượng phenol từ quá trình tách chiết DNA. Nucleic acid mục tiêu được thu từ các mẫu mô, tế bào hay mẫu vi sinh vật, thông qua quá trình tinh sạch và làm giàu. Trước khi thực hiện các thử nghiệm khác với nucleic acid, chúng ta cần phải kiểm soát chất lượng về nồng độ, độ tinh sạch hay tính toàn vẹn của mẫu. Cụ thể hơn về nồng độ nucleic acid, như chúng ta đã biết để phản ứng có thể xảy ra, các chất phải ở một nồng độ nhất định. Đo nồng độ của nucleic acid trong mẫu nhằm kiểm tra, mẫu có đạt được yêu cầu của thí nghiệm hay không. Đối với độ tinh sạch của mẫu, nhằm xác định xem mẫu có thể bị tạp nhiễm bởi các nucleic acid khác, protein hay các chất hoá học khác hay không. Tính toàn vẹn là đánh giá xem mẫu nucleic acid có bị hư hại hay không.
Để xác định nồng độ và độ tinh sạch của nucleic acid cần phải đo được giá trị hấp thu quang phổ ở A230, A260 và A280 (cho nồng độ) và giá trị A260/A280; A260/A230 (cho độ tinh sạch).
Giá trị hấp thụ quang phổ được xác định thông qua các máy đo quang phổ. Đối với các máy đo quang phổ thông thường thì mỗi lần đo cần tối thiểu 100μl và ít nhất là 30 phút để máy khởi động trước khi thực hiện đo mẫu. Nhìn chung các thao tác này khá rườm rà và phải tốn một lượng mẫu rất lớn. Hiện nay, hầu hết các phòng thí nghiệm điều trang bị Máy đo quang phổ vi thể tích, nó chỉ yêu cầu lượng mẫu vào khoảng 1 μl để xác định nồng độ và độ tinh sạch. Những lần đo tiếp theo cũng được thực hiện một cách dễ dàng hơn bằng việc vệ sinh đế giữ mẫu. Máy đo quang phổ vi thể tích (micro-volume) EzDrop 1000 là ứng cử viên sáng giá cho quá trình kiểm soát chất lượng nồng độ và độ tinh khiết của nucleic acid (DNA, RNA). Bạn chỉ cần 3 giây để thực hiện xong phép đo quang phổ để xác định độ tinh khiết và nồng độ nucleic acid có trong mẫu. Khoảng đo của EzDrop 1000 khá rộng, từ 190 đến 1000nm. Điểm đặc biệt tiếp theo, là phần đế giữ mẫu được phủ một lớp nano có tính kỵ nước, điều này nhằm đảm bảo tính chính xác của kết quả đo. Máy EzDrop 1000 còn có màn hình cảm ứng, các thao tác có thể thực hiện một cách dễ dàng và nhanh chóng. EzDrop 1000 có thể giúp cho quá trình kiểm soát chất lượng mẫu nucleic acid của bạn trở nên vô cùng dễ dàng.
Máy Đo Quang Phổ Vi Thể Tích EzDrop 1000 (Micro-volume)
Giao diện chính của máy EzDrop 1000
Nút “Nucleic Acid” ở giao diện chính của máy EzDrop 1000. Ấn vào nút này để đo nồng độ DNA hay RNA của mẫu. Sau khi các dữ liệu lưu trước đó được xoá, tiến hành nạp 1-2 μl mẫu vào giá mang mẫu. Sau 3 giây, máy sẽ hiển thị nồng độ mẫu. Bên cạnh giá đỡ mẫu sẽ có một đèn LED phụ, nhằm giúp tránh được các lỗi rơi rớt mẫu. Lớp nano kỵ nước phủ lên bề mặt giá đỡ giúp tăng cường sự ổn định của cột chất lỏng trong đế giữa mẫu, giảm lượng mẫu còn sót lại sau khi loại bỏ mẫu khỏi đế. Các thiết kế này nhằm đảm bảo tính chính xác của phép đo cũng như độ chính xác của kết quả.
Kiểm tra độ tinh sạch của DNA, phương pháp đo hấp thu quang phổ vi thể tích xác định độ tinh khiết của DNA bằng các dựa vào các tỷ lệ A260/230 và A260/280. Tỷ lệ A260/280 của mẫu DNA đạt 1,8-2,0 là mẫu đạt độ tinh sạch mong muốn. Nếu mẫu chứa bất kỳ tạp chất protein hay phenol nào thì tỷ lệ này sẽ bị thay đổi. Tỷ lệ A260/280 sẽ giảm xuống dưới 1,6 thì mẫu có thể chứa các chất tạp nhiễm như protein hay phenol. Trong trường hợp tỷ lệ A260/280 lớn hơn 2, diều này cho thấy RNA không bị loại bỏ hoàn toàn hoặc DNA hư hại.
Thiết kế đèn hỗ trợ LED EzDrop 1000 v2
Tương tự như DNA, độ tinh sạch của RNA cũng được kiểm tra thông qua mức độ hấp thu quang phổ, các tỷ lệ hấp thu được dùng để xác định là A260/230 và A260/280. Nhìn chung, tỷ lệ A260/280 nằm trong khoảng 1,8~2,0 cho thấy RNA có độ tinh sạch cao. Nếu tỷ lệ A260/280 lớn hơn 2,0 thì chứng tỏ RNA đã bị hư hại. Tỷ lệ A260/280 nhỏ hơn 1,8 thì mẫu chứa protein hoặc các tạp chất khác. Khi tỷ lệ 260/230 giảm xuống dưới 2, điều này cho thấy trong mẫu RNA có chứa tạp chất phenol hoặc muối.
Giao diện đo mẫu DNA của máy EzDrop 1000
Đối với các nghiên cứu trong lĩnh vực sinh học phân tử, ngoài yêu cầu về nồng độ hay chất lượng tổng thể của mẫu ra thì mức độ toàn vẹn của mẫu là yếu tố then chốt để đánh giá chất lượng mẫu. Vì vậy, các thao tác kiểm tra đánh giá tính toàn vẹn của mẫu rất cần thiết. Phương pháp điện di mao quản là phương pháp tốt nhất để kiểm soát chất lượng tính toàn vẹn của mẫu nucleic acid.
Hệ thống điện di mao quản là một ví dụ điển hình, phần mềm của hệ thống có thể đánh giá chất lượng của DNA một cách cực kỳ hiệu quả. Phần mềm phân tích dữ liệu dựa trên mức độ hư hại của mẫu và tỷ lệ mẫu vượt ngưỡng yêu cầu, nhằm đưa ra giá trị DQN (DNA Quality Number). Giá trị DQN thường nằm trong khoảng từ 0 đến 10. Giá trị DQN càng cao biểu thị độ toàn vẹn của mẫu cao hơn và chất lượng mẫu tốt hơn.
So sánh giá trị DQN của 2 mẫu gentic-DNA có chất lượng khác nhau
Enzyme ribonuclease có gần như ở mọi nơi, nên mẫu RNA rất có khả năng bị phân huỷ. RNA bị phân huỷ thì các bước thí nghiệm tiếp theo được xem như thất bại. Do đó, kiểm soát chất lượng tính toàn vẹn của mẫu RNA là cực kỳ quan trọng. Mẫu RNA tổng số có mức phân huỷ thấp (như RNA tách chiết từ máu và mô tươi), phần mềm của hệ thống điện di mao quản sẽ hiển thị thông số giá trị số lượng RNA đạt chất lượng (RNA quality number, RQN). Thông số RQN sẽ nằm trong khoảng từ 0 đến 10 dưa trên tính toàn vẹn và tỷ lệ diện tích đỉnh của vùng 18s và 28s. Giá trị RQN càng cao biểu thị tính toàn vẹn và chất lượng của mẫu càng cao.
Giá trị RQN của 2 mẫu RNA có chất lượng khác nhau
Đối với mẫu RNA dễ bị phân huỷ (như RNA tách chiết từ FFPE, viết tắt từ formalin-fixed, paraffin-embedded), 18s và 28s thường gần như bị phân huỷ. Do đó, sử dụng giá trị RQN trong trường hợp này là không phù hợp. Khi đó, giá trị DV200 thường được sử dụng để đánh giá thay cho giá trị RQN, DV200 biểu thị cho tỷ lệ mẫu RNA có kích thước lớn 200nt về chiều dài. Giá trị DV200 càng cao thì chất lượng mẫu càng cao và độ phân huỷ của mẫu càng thấp.
Giá trị DV200 của 2 mẫu RNA có chất lượng khác nhau
Nói chung, tích hợp hệ thống điện di mao quản và máy đo quang phổ vi thể tích để kiểm soát nồng độ, độ tinh sạch và tính toàn vẹn của mẫu nucleic acid. Điều này có thể giúp cho chúng ta có được công cụ hữu hiệu để kiểm soát chất mẫu nucleic acid một cách hữu hiệu nhất và chính xác nhất. Đồng thời, hạn chế tối đa các lỗi có thể mắc phải khi thực hiện các thí nghiệm sinh học phân tử.
