Vì sao cần đánh giá hình thái của hPSCs

Việc nuôi cấy tế bào gốc đa năng của con người (hPSCs) hiện có một số thách thức hơn khi so sánh với việc nuôi cấy các tế bào kết dính khác. Các kỹ thuật theo dõi và xử lý cẩn thận là rất quan trọng để đảm bảo duy trì và mở rộng các tế bào khỏe mạnh ở trạng thái không phân hóa trong thời gian dài.
Mặc dù các đánh giá trực quan có thể mang tính chủ quan, nhưng những thay đổi có thể nhìn thấy được giúp chúng ta đánh giá chất lượng hPSC. Việc nuôi cấy nên được kiểm tra hàng ngày bằng kính hiển vi với ánh sáng có độ tương phản để theo dõi chất lượng của các tế bào, cũng như để kiểm tra xem chúng đã sẵn sàng để “pass cell” chưa.
Cần lưu ý rằng không phải tất cả những thay đổi về ngoại hình đều thể hiện sự giảm sút về chất lượng. Việc có các biến thể do một số yếu tố là điều bình thường. Sau đây là các mẹo kỹ thuật mô tả hình thái dự kiến của các tế bào chất lượng cao, một số biến thể bình thường phổ biến và các biến thể khác có thể cho thấy chất lượng tế bào kém.

Hình thái cụm tế bào khỏe mạnh và các biến thể bình thường

Việc đánh giá chất lượng hPSC có thể khó khăn trong vài ngày đầu sau khi “passaging” và trở nên dễ dàng hơn khi các cụm tế bào trưởng thành. Điều này thường xảy ra khoảng 48 giờ trước thời gian “passaging” tối ưu. Dưới độ phóng đại thấp, hPSC chất lượng cao và khỏe mạnh phải thể hiện các đặc điểm sau:

• Cụm tế bào tương đối tròn
• Tế bào được đóng gói chặt chẽ với tỷ lệ nhân: tế bào chất cao, nơi nhân thực tế là nơi cư trú của toàn bộ tế bào
• Hạt nhân nổi bật
• Các trung tâm cụm tế bào trở nên rất dày đặc và có thể xuất hiện ở dạng pha sáng hơn khi quan sát dưới kính hiển vi có độ tương phản

Hình 1. Các cụm tế bào hPSC chất lượng cao gần thời gian “passaging” tối ưu

Một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến hình thức trực quan của cụm tế bào bao gồm số ngày kể từ lần “passaging” hoặc lần thêm môi trường cuối cùng, dòng tế bào được sử dụng, môi trường được sử dụng, phương pháp “passaging”. Dưới đây là một số biến thể mà bạn có thể nhận thấy, được coi là bình thường và không nhất thiết là dấu hiệu của chất lượng tế bào kém:

1. Các cạnh cụm tế bào "có gai" và đóng gói lỏng lẻo hơn trong những ngày đầu tiên sau khi “passage”  

Trong tối đa 4 ngày sau khi cấy, các cụm tế bào có thể biểu hiện sự đóng gói lỏng lẻo hơn khi các cụm tế bào lan rộng ra và hình thành. Tại thời điểm này, các cạnh của cụm tế bào có nhiều gai nhọn không phải là nguyên nhân đáng lo ngại. Mật độ và độ chắc của cụm tế bào tăng nhanh sau mốc thời gian này và hình thái thay đổi đáng kể trong 1 - 2 ngày cuối cùng trước khi “passaging”.

Hình 2. Tế bào gốc phôi người (ES) (H9) Hai ngày sau khi “passaging” với các cạnh cụm tế bào có gai (Mũi tên màu cam)

2.    Các cụm tế bào không đối xứng và/hoặc hợp nhất

Các cụm tế bào có thể hơi không đối xứng và hợp nhất, đặc biệt là vào thời điểm “passaging”. Đây thường không phải là nguyên nhân đáng lo ngại. Các cụm tế bào hợp nhất cũng có thể xảy ra khi các tập hợp được cấy ở mật độ thấp và không được phân tán tốt. Một lần nữa, đây thường không phải là nguyên nhân đáng lo ngại. Sự đối xứng của các cụm tế bào có thể khác nhau không chỉ giữa các dòng tế bào mà còn giữa các nền, với các hPSC được nuôi cấy trong Vitronectin XF ™ (STEMCELL Technology) thường trông nhỏ gọn và đối xứng hơn.

Hình 3. (A) Tế bào gốc đa năng cảm ứng (iPS) người, tế bào WLS-1C nuôi cấy trong Vitronectin XF ™ và (B) Tế bào ES của người (H9) trên Corning® Matrigel®

Phần tiếp theo bao gồm một số ví dụ về hình thái cần được theo dõi thêm, cho thấy chất lượng tế bào giảm.

Các biến thể về hình thái cho thấy chất lượng tế bào kém

Các khu vực biệt hóa

Các cụm tế bào hPSC khỏe mạnh biểu hiện một lượng thấp (5-10%) sự biệt hóa tự phát là điều bình thường. Tuy nhiên, sự gia tăng các khu vực biệt hóa là dấu hiệu của các hPSC kém chất lượng. Đáng chú ý, các dấu hiệu của sự biệt hóa có thể xuất hiện trước khi biểu hiện dấu hiệu (marker) giảm.

Dưới đây là một số đặc điểm của hình thái cụm tế bào kém cho thấy chất lượng tế bào giảm

• Sự biệt hóa tự phát tăng (> 10%)
• Mất tính đồng nhất
• Độ sáng hoặc nhiều lớp xuất hiện "lốm đốm", rời rạc và không ở trung tâm của cụm tế bào
• Mất tính toàn vẹn của cụm tế bào
• Đóng gói tế bào lỏng lẻo

Hình 4. (A) Các khu vực biệt hóa tự phát và (B) Mất tính toàn vẹn của cụm tế bào và các tế bào bị biệt hóa (Mũi tên màu cam) trong các cụm tế bào STiPS-M001

Hình 5. (A) Tế bào được đóng gói chặt chẽ so với (B) Tế bào được đóng gói lỏng lẻo với khoảng cách pha sáng có thể nhìn thấy giữa các tế bào trong cụm tế bào hPSC (Mũi tên màu cam)