Cách Bảo Quản Lạnh Tế Bào Đơn Nhân Máu Ngoại Vi

Bảo quản lạnh là một phương pháp thường được sử dụng để lưu trữ dài hạn các tế bào, bao gồm các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMCs) của người được phân lập từ máu toàn phần hoặc bạch cầu. Để bảo quản lạnh PBMC, các tế bào được thêm vào môi trường bảo quản lạnh, được làm lạnh đến nhiệt độ cực thấp, sau đó được bảo quản ở nhiệt độ nitơ lỏng (dưới -135°C) cho đến khi cần sử dụng. Khi các tế bào được cần sử dụng, các PBMC đang được bảo quản lạnh có thể được rã đông và sau đó được sử dụng trong xử lý tiếp theo, như được phân lập thành tập hợp con tế bào (cell subset) bằng sản phẩm EasySep™.

Công thức môi trường bảo quản lạnh do phòng thí nghiệm tạo ra thường chứa huyết thanh thai bò (FBS), một thành phần giàu chất dinh dưỡng giúp bảo vệ tế bào và giúp chúng phục hồi sau khi rã đông. Tuy nhiên, việc sử dụng FBS làm dấy lên lo ngại về sự thay đổi theo lô và nguy cơ lây truyền các tác nhân lây nhiễm có khả năng xảy ra. FBS thường không được khuyến nghị cho các ứng dụng thương mại hoặc lâm sàng, chẳng hạn như sản xuất các sinh phẩm. DMSO (Dimethyl sulfoxide), một chất phụ gia khác giúp bảo vệ tế bào chống lại sự ly giải thẩm thấu, cũng là một chất bảo vệ lạnh được sử dụng rộng rãi trong môi trường bảo quản lạnh.

Việc sử dụng môi trường bảo quản lạnh, nồng độ tế bào và tốc độ làm lạnh thích hợp sẽ đảm bảo PBMCs duy trì khả năng sống và tăng trưởng sau khi rã đông. Protocol bảo quản lạnh thành công PBMC được giới thiệu sau đây:

Sử dụng môi trường bảo quản lạnh không chứa huyết thanh: CryoStor® CS10 là môi trường bảo quản lạnh chứa 10% DMSO, không có thành phần huyết thanh và động vật, bảo vệ an toàn cho tế bào và mô trong quá trình đông lạnh, bảo quản và rã đông.

Vật liệu thực hiện bảo quản lạnh

• Môi trường bảo quản tế bào CryoStor® CS10 (Catalog #07930 hoặc #07931).
• Ống cryotube bảo quản tế bào.
• Thiết bị hạ nhiệt độ theo chương trình (controlled-rate freezer).
• Pipet và đầu tip.

Protocol bảo quản lạnh sử dụng CryoStor® CS10

1. Lau sạch bên ngoài hộp/ chai đựng CryoStor® CS10 bằng dung dịch 70% etanol hoặc isopropanol trước khi mở nắp.
2. Dán nhãn ống vial đông lạnh.
3. Đảm bảo PBMC ở dạng huyền phù đơn bào. Ly tâm tế bào ở tốc độ 300 xg trong 10 phút để thu được viên tế bào (cell pellet).
4. Cẩn thận loại bỏ phần nổi phía trên bằng pipet, để lại một lượng nhỏ môi trường để đảm bảo viên tế bào không bị xáo trộn.
5. Làm loãng lại (dạng huyền phù) viên tế bào bằng cách búng nhẹ ống.
6. Thêm CryoStor® CS10 lạnh (2-8°C), trộn kỹ và chuyển dịch huyền phù sang ống vial đông lạnh.
7. Lưu ý: Nên làm đông lạnh các PBMC đã phân lập ở nồng độ 0,5-10 x 10⁶ tế bào/mL. Tuy nhiên, bạn nên thử đông lạnh tế bào ở các nồng độ để xác định nồng độ nào cho khả năng sống, phục hồi và tăng sinh tốt nhất sau rã đông. Nồng độ tế bào cao hơn được đông lạnh phải cần được xác nhận và tối ưu hóa phương pháp đông lạnh.
8. Ủ tế bào ở 2 - 8°C trong 10 phút.
9. Thực hiện bảo quản lạnh tế bào bằng sử dụng thiết bị CRF kiểm soát nhiệt độ theo chương trình (khoảng -1°C/ phút) hoặc sử dụng thùng đông lạnh isopropanol. Nếu sử dụng hộp đông lạnh isopropanol, hãy đặt các lọ đông lạnh vào hộp và đặt trong tủ đông -80°C qua đêm.
10. Để bảo quản trong thời gian dài, hãy chuyển các ống vial PBMC đông lạnh từ tủ đông hoặc thùng đông lạnh sang bình nitơ lưu trữ tế bào (ở pha hơi nitơ lỏng có nhiệt độ dưới -135°C). Nhằm giảm thiểu tiếp xúc với nhiệt độ phòng bằng cách đặt ống vial PBMC trên đá khô trong quá trình chuyển sang bình nitơ lưu trữ tế bào.

Lưu ý: Không nên bảo quản BPMC lâu dài ở nhiệt độ -80°C.

(Nguồn: Công ty STEMCELL Technologies - Canada).