Do những thay đổi trong luật (Đạo luật về đảm bảo chất lượng, hiệu quả và an toàn của sản phẩm bao gồm dược phẩm và thiết bị y tế, Đạo luật về an toàn của sản phẩm thuốc tái tạo, v.v.) vào năm 2012, ứng dụng thương mại của các sản phẩm thuốc tái tạo hiện đã được cho phép. Cùng với đó, xét nghiệm mycoplasma đã trở thành bắt buộc như một phần của các xét nghiệm để đảm bảo an toàn cho các sản phẩm thuốc tái tạo.
Dược điển Mỹ, Châu Âu và Nhật Bản: Kỹ thuật khuếch đại axit nucleic đã được bổ sung như một phương pháp xét nghiệm nhanh mycoplasma.
Mycoplasma là vi khuẩn không vách tế bào, kích thước nhỏ (0,2- 0,8µm), có hình dáng đa dạng.
Mycoplasma, Ureaplasma, Spiroplasma, Acholeplasma và các vi khuẩn khác thuộc Động vật thân mềm (Mollicutes).
Với những đặc trưng này, khó phát hiện nhiễm mycoplasma.
Có nhiều báo cáo rằng các tế bào nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm thường bị nhiễm mycoplasma. Việc phát triển các sản phẩm y tế sử dụng tế bào bị ô nhiễm sẽ dẫn đến hậu quả nghiêm trọng.
Do vậy, Chất nền nuôi cấy tế bào được sử dụng để phát triển các sản phẩm y tế và sản phẩm y tế dựa trên tế bào/mô cần được thực hiện kiểm tra/ xét nghiệm mycoplasma thích hợp.
Hiện có các phương pháp ứng dụng phát hiện Mycoplasma như: nhuộm mô học, quan sát đưới kính hiển vi điện tử (TEM, SEM), phương pháp sinh hóa (thử nghiệm dựa trên enzyme), phương pháp nuôi cấy, phương pháp nhuộm huỳnh quang DNA (DAPI stain), và phương pháp khuếch đại axit nucleic (phương pháp NAT) bằng kỹ thuật PCR.
Đối với các sản phẩm nuôi cấy trên 48 giờ, FDA yêu cầu xét nghiệm mycoplasma. USP đã phê duyệt quy trình mycoplasma thường được chấp nhận ở Hoa Kỳ, Nhật Bản và Liên minh Châu Âu. FDA Mỹ đã đồng ý với việc sử dụng các phương pháp thay thế như phương pháp khuếch đại axit nucleic (phương pháp NAT) bằng kỹ thuật PCR, được chấp nhận bởi dược điển Châu Âu, Nhật Bản và Hoa Kỳ hoặc các xét nghiệm dựa trên enzyme (enzyme-based assays), nhưng yêu cầu dữ liệu thẩm định (validation data) để sử dụng chúng trong công bố sản phẩm.
7 loại chủng đã được chọn từ các quan điểm sau đây là các chủng mycoplasma có thể gây ô nhiễm chất nền tế bào được sử dụng để phát triển các sản phẩm y tế tại Nhật Bản.
Tần suất ô nhiễm và quan điểm phát sinh loài.
Các thành phần có nguồn gốc từ động vật được sử dụng trong nuôi cấy tế bào.
| Chủng mycoplasma | Vật chủ tự nhiên |
| Mycoplasma hyorhinis | Lợn |
| Mycoplasma orale | Người |
| Mycoplasma pneumoniae | Người |
| Mycoplasma salivarium | Người |
| Acholeplasma laidlawii | Bò |
| Mycoplasma fermentans | Người |
| Mycoplasma arginini | Bò/ dê |
Cấy mẫu vào môi trường (môi trường lỏng, môi trường thạch) và nuôi cấy để phát hiện các khuẩn lạc đặc trưng cho mycoplasma. Thời gian từ khi bắt đầu nuôi cấy đến khi kết thúc xét nghiệm là 28 ngày.
Phương pháp này gián tiếp phát hiện mycoplasma đã phát triển trong nuôi cấy tế bào bằng cách cấy các tế bào chỉ thị (tế bào Vero) với mẫu xét nghiệm và nhuộm DNA của mycoplasma bằng thuốc nhuộm huỳnh quang để quan sát các đốm huỳnh quang nhỏ ngoài nhân.
Phương pháp nhuộm DNA cần chuẩn bị các tế bào chỉ thị, rất khó để đánh giá kết quả vì đây không phải là phương pháp dành riêng cho mycoplasma và cần kỹ thuật viên có kinh nghiệm và kỹ năng để đánh giá mẫu dương tính hay âm tính.
Ly trích DNA từ mẫu và khuếch đại chúng bằng cách sử dụng mồi đặc hiệu cho mycoplasma để phát hiện mycoplasma.
Theo Dược điển Nhật Bản, Châu Âu yêu cầu phương pháp NAT cần được thẩm định (nếu đủ độ nhạy được xác nhận thông qua thẩm định hợp lệ), phương pháp này có thể được sử dụng thay thế cho Phương pháp A (Phương án thay thế cho Phương pháp A: Có thể phát hiện được 10CFU/mL đối với tất cả 7 chủng mycoplasma) và Phương pháp B (Phương án thay thế cho Phương pháp B: Có thể phát hiện được 10CFU/mL đối với tất cả 7 chủng mycoplasma).
Kỹ thuật khuếch đại axit nucleic (kỹ thuật NAT) có thể được sử dụng như một phương pháp xét nghiệm mycoplasma nhanh chóng có độ nhạy và độ đặc hiệu vượt trội, miễn là việc thẩm định hợp lệ được thực hiện.
MycoFinder sử dụng Real-Time PCR để phát hiện mycoplasma chính xác, một phương pháp xét nghiệm nhạy, nhanh chóng, đáng tin cậy và tiết kiệm chi phí để kiểm soát chất lượng dược phẩm sinh học và Sản phẩm Thuốc trị liệu Tiên tiến (ATMP).
Một kiểu xét nghiệm sáng tạo của bộ kít MycoFinder giảm thiểu việc xử lý mẫu, dễ dàng chuẩn bị mẫu và giảm đáng kể thời gian quay vòng. Dễ sử dụng và thực hiện trong phòng thí nghiệm, nơi thời gian là rất quan trọng. MycoFinder tuân thủ Dược điển Châu Âu, Hoa Kỳ và Nhật Bản (EP 2.6.7, USP63 & JP17).
Thực hiện xét nghiệm mycoplasma nhanh:
Tuân thủ dược điển:
Chi phí xét nghiệm hiệu quả:
Không cần chuẩn bị thuốc thử vì thuốc thử phản ứng khô được đặt trong ống phản ứng cho mỗi ống (giếng qPCR).
Khi sử dụng enzyme khuếch đại mạnh, quá trình phát hiện có thể hoàn tất trong vòng một giờ kể từ khi bắt đầu khuếch đại.
Có thể xác định được kết quả dương tính giả do nhiễm bẩn mẫu âm tính bằng kiểm soát dương tính.
Bộ kit này có thể phát hiện mycoplasma trong quá trình nuôi cấy tế bào ⇒ Nó không chỉ được sử dụng để kiểm tra các sản phẩm cuối cùng mà còn để kiểm tra tự nguyện trong quá trình nuôi cấy.
Ghi chú:
Người dùng có phải thực hiện thẩm định đầy đủ tại cơ sở của họ không? thao dược điển JP17 “Khi một bộ kit có sẵn trên thị trường được sử dụng để kiểm tra NAT, dữ liệu xác thực đầy đủ từ nhà sản xuất có thể được sử dụng thay thế cho dữ liệu xác thực của người dùng”. Do vậy, nếu có sẵn dữ liệu thẩm của nhà sản xuất, người dùng không phải thực hiện việc thẩm định đầy đủ.
Tuy nhiên, có sự khác biệt về loại tế bào của mẫu, phương pháp ly trích DNA, thiết bị real-time PCR, v.v. có thể ảnh hưởng đến độ nhạy và độ lập lại. Do đó, cần phải thực hiện thẩm định hiệu quả của bộ kít tại cơ sở người dùng.
Người dùng cần xác nhận rằng có thể nhận được kết quả thẩm định giống như kết quả do nhà sản xuất trình bày tại các cơ sở của chính họ.
Độ đặc hiệu của phương pháp tùy thuộc vào sự lựa chọn trình tự mồi và mẫu dò (probe) (để phân tích sản phẩm cuối cùng) và tính nghiêm ngặt của các điều kiện thử nghiệm (ở cả bước khuếch đại và phát hiện).
Các chi vi khuẩn Gram dương có quan hệ phát sinh loài gần với Mycoplasma là thích hợp nhất được dùng để xác định độ đặc hiệu của phương pháp, bao gồm Clostridium, Lactobacillus và Streptococcus.
Tuy nhiên, đây chưa phải là danh sách đầy đủ, và các loài được kiểm tra sẽ phụ thuộc vào khả năng lý thuyết (dựa trên trình tự mồi và mẫu dò) của phương pháp để phát hiện các loài khác.
Trong trường hợp phương pháp phát hiện acid nucleic của vi khuẩn không phải Mycoplasma, cần có chiến lược thích hợp để giải thích kết quả dương tính theo một nền tảng quen thuộc.
Để xác định giới hạn phát hiện, cần xác định điểm giới hạn dương đối với quy trình phân tích và khuếch đại. Điểm giới hạn dương là số lượng bản sao trình tự mục tiêu tối thiểu trên một thể tích mẫu có thể phát hiện trong 95% số lần chạy thử nghiệm.
Điểm giới hạn dương bị ảnh hưởng bởi số lượng bộ gene Mycoplasma trong các mẫu riêng biệt đang kiểm tra và các yếu tố khác như hiệu quả enzyme, có thể dẫn đến các giá trị ngưỡng 95% khác nhau trong những lần thử nghiệm phân tích riêng lẻ.
Để xác định được điểm giới hạn dương, một loạt các giá trị được pha loãng của mẫu dương tính chuẩn được thử nghiệm vào các ngày khác nhau để kiểm tra sự thay đổi giữa các lần chạy thử nghiệm.
Các loài đại diện cho các lựa chọn tối ưu về tần suất xuất hiện gây ô nhiễm, cũng như mối quan hệ phát sinh loài được dùng để xác nhận giới hạn phát hiện là:
Đối với mỗi chủng, cần kiểm tra ít nhất 3 dãy pha loãng hàng loạt 1/10 lần trong các thử nghiệm độc lập, với số lần lặp lại ở mỗi độ pha loãng sao cho cung cấp tổng số 24 kết quả thử nghiệm cho mỗi độ pha loãng, cho phép phân tích thống kê các kết quả.
Để kiểm soát số lượng độ pha loãng hàng loạt, cần thực hiện thử nghiệm sơ bộ để nhận biết giá trị giả định cho điểm giới hạn dương (độ pha loãng cao nhất cho tín hiệu dương tính). Sau đó lựa chọn phạm vi pha loãng xung quanh điểm giới hạn dương giả định đó. Nồng độ Mycoplasma (tính theo CFU hoặc bản sao) được phát hiện trong 95% số lần thử nghiệm sẽ được tính toán bằng đánh giá thống kê thích hợp.
Những kết quả này cũng được dùng để đánh giá sự biến đổi của quy trình phân tích.
Đối với phương pháp NAT, các biến đổi nhỏ của các tham số rất quan trọng, ví dụ nồng độ của các thành phần phản ứng khuếch đại (MgCl2, primer/probe, dNTPs…), hoặc những biến đổi trong bộ kit tách chiết hoặc quy trình tách chiết, cũng như sự thay đổi của các chu trình nhiệt khác nhau. Tất cả các biến đổi đó sẽ được đánh giá và tổng hợp lại để đưa ra kết luận về độ chắc chắn của phương pháp.
NAT có thể được sử dụng thay thế cho các phương pháp chính thức (phương pháp nuôi cấy tế bào chỉ thị và/hoặc phương pháp nuôi cấy vi khuẩn). Việc so sánh phương pháp NAT với các phương pháp chính thức chủ yếu dựa trên giới hạn phát hiện của phương pháp. Tuy nhiên, cũng nên xem xét chỉ tiêu về độ đặc hiệu.
Đối với chỉ tiêu giới hạn phát hiện, tiêu chí được đánh giá dựa trên:
Các báo cáo nghiên cứu so sánh các phương pháp phải được mô tả tất cả các tiêu chí thẩm định (độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện và sự biến đổi, cũng như độ chắc chắn) để đánh giá ưu và nhược điểm của phương pháp NAT thay thế so với các phương pháp chính thức.
