Tổng quan về Bộ kit HepatiCult™ Organoid Kit (Human)

Bộ kit HepatiCult™ Organoid Kit (Human) tạo ra, mở rộng và biệt hóa các cơ quan gan người có liên quan đến sinh lý một cách đáng tin cậy. So với các hệ thống mô hình được sử dụng theo truyền thống như dòng tế bào và mô hình động vật, các cơ quan gan người cung cấp một hệ thống mô hình có liên quan hơn để nghiên cứu sự phát triển, tái tạo, chuyển hóa và bệnh tật của gan.

Bộ kit chứa tất cả các thành phần cần thiết để nuôi cấy organoid gan người từ mô gan người tươi hoặc đông lạnh.

Tính năng nổi bật của Bộ kit HepatiCult™ Organoid Kit (Human): 

• Cung cấp một hệ thống nuôi cấy hoàn chỉnh để thiết lập, duy trì và biệt hóa các organoid gan người

• Cho phép khởi đầu organoid hiệu quả trên các mô gan của người hiến tặng khác nhau

• Tạo ra các organoid gan trưởng thành thể hiện hoạt động của CYP3A4

• Cho phép linh hoạt thử nghiệm với các định dạng nuôi cấy khác nhau

Ứng dụng: nuôi cấy organoid

Thành phần bộ kit: HepatiCult™ Organoid Kit (Human) (Catalog #100-0386) bao gồm: 

• HepatiCult™ Organoid Basal Medium (Human) (Catalog #100-0387), 3 chai x 95 mL/chai: Tạo ra organoid gan một cách hiệu quả trên nhiều dòng hiến tặng khác nhau.

• Organoid Supplement (Catalog #100-0191), chai 50 mL: Bổ trợ cho quá trình tạo ra organoid gan một cách hiệu quả

• HepatiCult™ Organoid Growth Supplement (Human) (catalog #100-0389), 2 lọ x 5 mL/lọ: Mở rộng và duy trì organoid gan cho mục đích thử nghiệm hoặc lưu trữ sinh học trong tương lai.

• HepatiCult™ Organoid Differentiation Supplement (Human) (catalog #100-0388), 5 mL/lọ: Tạo ra organoid trưởng thành thể hiện chức năng gan, bao gồm hoạt động của CYP3A4. Các organoid này có thể được điều chỉnh cho phù hợp với nhiều quy trình nuôi cấy, bao gồm nuôi cấy lớp đơn 2D, nuôi cấy huyền phù và xét nghiệm thông lượng cao

Kết quả dự kiến:  

Hình 1. Bộ kit HepatiCult™ Organoid (Người) cho phép khởi đầu, mở rộng và biệt hóa organoid gan

Các organoid gan của người có thể được nuôi cấy từ các ống gan có nguồn gốc từ mô gan người bình thường bằng cách sử dụng Bộ kit HepatiCult™ Organoid (Người). (A) Nuôi cấy trong Môi trường HepatiCult™ Organoid Initiation Medium (OIM; Người) hoặc Môi trường HepatiCult™ Organoid Growth (OGM; Người) (xem Bảng 1 bên dưới) và sau đó chuyển qua HepatiCult™ OGM để mở rộng. (B) Sau khi chuyển qua HepatiCult™ OGM 2-3 lần, mẫu cấy có thể được chuyển sang Môi trường biệt hóa HepatiCult™ Organoid (ODM; Người) để biệt hóa các organoid gan thành các loại tế bào gan trưởng thành. Tham khảo Hướng dẫn sản phẩm (Tài liệu #10000008301) để biết quy trình nuôi cấy đầy đủ.

Bảng 1. Khuyến nghị về sản phẩm để khởi đầu, mở rộng và biệt hóa organoid gan

Cấu hình được đề xuất của Bộ kit HepatiCult™ Organoid (Người) có thể khác nhau dựa vào nguyên liệu ban đầu và mục tiêu thử nghiệm. Khi thiết lập mẫu nuôi cấy organoid gan từ mô gan người, nên sử dụng HepatiCult™ Organoid Initiation Medium (OIM; Người) để khởi đầu nuôi cấy organoid hiệu quả (xem Hình 2 bên dưới). Môi trường HepatiCult™ Organoid Growth Medium (OGM; Người) hỗ trợ việc mở rộng các organoid đã thiết lập (tươi trong nuôi cấy hoặc bảo quản đông lạnh). Các organoid này nên được duy trì trong 2-3 lần cấy trước khi biệt hóa thêm bằng Môi trường biệt hóa HepatiCult™ Organoid Differentiation Medium (ODM). Tham khảo Hướng dẫn sản phẩm (Tài liệu #10000008301) để biết đầy đủ các quy trình nuôi cấy.

Hình 2. Bộ dụng cụ HepatiCult™ Organoid (Người) cung cấp khởi đầu Organoid hiệu quả từ mô gan người

(A) Nuôi cấy organoid được khởi đầu trong HepatiCult™ OIM, sau đó (B) chuyển vào HepatiCult™ OGM. Đối với điều kiện nuôi cấy không có huyết thanh, nuôi cấy organoid được (C) khởi đầu và (D) chuyển vào HepatiCult™ OGM. Hình ảnh nuôi cấy được hiển thị từ (A, C) ngày 15 sau khi khởi đầu và (B, D) vào ngày 8 của lần cấy chuyền đầu tiên. (E) Định lượng hiệu quả khởi đầu organoid cho thấy sản lượng organoid cao hơn đáng kể trong HepatiCult™ OIM trên mỗi gam mô gan người (mean ± SD; n = 14).

Hình 3: Môi trường HepatiCult™ Organoid Initiation (Người) hỗ trợ việc thiết lập organoid mạnh mẽ trên nhiều mẫu mô gan hiến tặng

Organoid khởi đầu từ 4 mẫu mô hiến tặng (A-D) biểu hiện tính không đồng nhất về mặt hình thái sau 15 ngày khởi đầu. Tất cả các mẫu nuôi cấy khởi đầu sau đó được mở rộng trong HepatiCult™ OGM bằng cách sử dụng tỷ lệ truyền 1:1 (E-H), tạo ra các organoid khỏe mạnh vào cuối giai đoạn đầu tiên.

Hình 4. Sự mở rộng của các mẫu nuôi cấy organoid trong HepatiCult™ Organoid Growth Medium

Các organoid gan cho thấy sự phát triển hiệu quả trong HepatiCult™ OGM trên nhiều người hiến tặng và các lần chuyền với tiềm năng nuôi cấy vô thời hạn. Các organoid được khởi đầu bằng quy trình không có huyết thanh cho thấy tốc độ tăng trưởng tương đương khi được mở rộng trong HepatiCult™ OGM (các dấu hiệu (marker) mở).

Hình 5. Các cơ quan gan tăng sinh thể hiện các đặc điểm của tiền thân gan

Các cơ quan gan người được nuôi cấy trong HepatiCult™ OGM thể hiện các đặc điểm của tiền thân gan tăng sinh được quan sát thấy thông qua nhuộm hóa mô miễn dịch tế bào của (A) KI67, (B) HNF4A và (C) SOX9. Các cơ quan gan tăng sinh cũng thể hiện các đặc điểm của biểu mô gan bao gồm biểu hiện của (A) EPCAM. (B, C) Nhân được nhuộm tương phản với DAPI.

Hình 6. Các cơ quan gan tăng sinh duy trì biểu hiện di truyền qua nhiều lần cấy chuyền

Các organoid gan được duy trì trong HepatiCult™ OGM biểu hiện các dấu hiệu (marker) tế bào gốc (A) LGR5 và (B) AXIN2, các dấu hiệu ống dẫn (C) SOX9 và (D) KRT19, cũng như dấu hiệu gan (E) HNF4a và (F) Albumin (ALB) qua nhiều lần cấy chuyền, với biểu hiện albumin tối thiểu được quan sát thấy trong quá trình nuôi cấy trong HepatiCult™ OGM. Mức độ biểu hiện được đo bằng qPCR và chuẩn hóa theo gen quản lý TBP và UBC để định lượng mức độ biểu hiện tương đối. (mean ± SD; n = 2-5 dòng organoid), * p < 0,05.

Hình 7. Sự biệt hóa của organoid gây ra những thay đổi về hình thái của organoid

Các organoid biểu hiện hình thái nhỏ gọn và dày đặc, thường bao gồm biểu mô dày lên, khi chuyển đổi nuôi cấy sang Môi trường biệt hóa HepatiCult™ Organoid Differentiation Medium (ODM). Hình ảnh hiển thị là cùng một mẫu nuôi cấy trong suốt quá trình biệt hóa, bao gồm (A) ngày thứ hai nuôi cấy trong HepatiCult™ OGM, (B) ngày thứ năm nuôi cấy, ngay sau khi chuyển đổi nuôi cấy organoid từ HepatiCult™ OGM sang HepatiCult™ ODM, (C) ngày thứ bảy nuôi cấy (hai ngày sau khi chuyển sang ODM), (D) ngày thứ mười nuôi cấy (năm ngày sau khi chuyển sang ODM) và (E) ngày thứ 15 nuôi cấy (mười ngày sau khi chuyển sang ODM). (F) Phóng đại phần hình chữ nhật được đánh dấu trong (E).

Hình 8. Sự biệt hóa của các cơ quan gan trong HepatiCult™ ODM gây ra những thay đổi trong biểu hiện gen phù hợp với sự trưởng thành của gan khi được phân tích bằng giải trình tự RNA

Các organoid mở rộng trong HepatiCult™ OGM biểu hiện các dấu hiệu liên quan đến các tế bào tiền thân gan tăng sinh và ống dẫn. Khi biệt hóa trong HepatiCult™ ODM, các organoid chuyển sang trạng thái trưởng thành hơn, với mức độ biểu hiện tăng lên của các gen liên quan đến các chức năng gan chính. Điều này bao gồm tổng hợp protein huyết thanh (ALB, SERPINA1), chuyển hóa thuốc giai đoạn 1 và 2 (CYP2C9, CYP3A4, UGT1A1, GSTA1), chuyển hóa glucose (SLC2A2, G6PC), tổng hợp axit mật (CYP27A1, BAAT) và tổng hợp urê (OTC). Các gen liên quan đến quá trình chuyển hóa lipid và cholesterol được biểu hiện ở mức độ tương tự trong cả các organoid OGM và ODM. Các cột biểu diễn 3 bản sao sinh học được phân tích bằng RNA-seq số lượng lớn ở các lần cấy chuyền thứ 7 - 9 vào ngày 5 trong HepatiCult™ OGM và ngày 15 trong HepatiCult™ ODM. Gen giữ nhà (housekeeping gene), TBP, được đưa vào làm đối chứng tham khảo.

Hình 9. Các organoid gan biệt hóa thể hiện chức năng của tế bào gan trưởng thành

Sau khi biệt hóa trong HepatiCult™ ODM, các organoid gan được thử nghiệm để xác định (A) tiết albumin, (B) hoạt động của CYP3A4, (C) tổng axit mật sản xuất và (D) urê sản xuất. Chức năng gan được so sánh với tế bào HepG2 và tế bào gan người nguyên phát (PHH), được nuôi cấy trong môi trường do nhà cung cấp khuyến nghị. Sự tiết albumin được phát hiện bằng bộ dụng cụ ELISA (Abcam), tổng sản xuất axit mật và urê được phân tích bằng bộ dụng cụ đo màu (colorimetric) (Abcam) và hoạt động của CYP43A4, liên quan đến hoạt động ban đầu mà không cần cảm ứng, được xác định bằng bộ dụng cụ Luciferin-IPA (Promega). (mean ± SD; n = 3 dòng organoid trong 2 thí nghiệm, n = 2-3 bản sao kỹ thuật của HepG2 trong 1 thí nghiệm và n = 3 mẫu tế bào hiến tặng PHH được bảo quản đông lạnh trong 1 thí nghiệm), * p < 0,05; ** p < 0,01.

 Hình 10. Hoạt động CYP3A4 có thể được điều chỉnh trong các organoid gan biệt hóa

Các mẫu nuôi cấy organoid trong HepatiCult™ ODM từ ba người hiến tặng khác nhau đã được đánh giá về hoạt động CYP3A4 (A) thông qua LC-MS/MS và (B) biểu hiện gen thông qua qPCR, cho thấy sự gia tăng phụ thuộc vào thời gian cho cả hai phép đo. Mức độ biểu hiện gen đã được chuẩn hóa thành các gen giữ nhà (housekeeping gene), TBP và UBC, và biểu hiện 'Ngày 0'. Để đánh giá xem hoạt động CYP3A4 có thể được điều chỉnh hay không, hai dòng organoid gan biệt hóa đã được xử lý bằng (C) calcitriol hoặc (D) ketoconazole. Hoạt động của CYP3A4 được đánh giá vào ngày thứ 15 của quá trình biệt hóa, ngày thứ 24 (các dấu hiệu mở) hoặc ngày thứ 48 sau điều trị bằng xét nghiệm P450-Glo™ CYP3A4 (Luciferin-IPA) (Promega). Cả hai dòng organoid gan biệt hóa đều cho thấy sự gia tăng đáng kể hoạt động của CYP3A4 khi nồng độ calcitriol tăng và sự giảm đáng kể hoạt động của CYP3A4 khi nồng độ ketoconazole tăng (n = 2 dòng organoid, giá trị trung bình từ 2 thí nghiệm). Error bars = SD. One-way ANOVA với phương pháp Dunnett được sử dụng để kiểm tra thống kê (**P ≤ 0,01, ****P ≤ 0,0001, ns = không đáng kể).

 Hình 11. Nồng độ thuốc cao làm gián đoạn quá trình tiết albumin ở các organoid gan biệt hóa

Các organoid từ hai người hiến tặng khác nhau đã được biệt hóa trong HepatiCult™ ODM và được xử lý bằng (A) troglitazone, (B) ketoconazole, (C) rifampicin hoặc (D) acetaminophen vào ngày thứ 7 của quá trình biệt hóa khi thực hiện làm mới môi trường cuối cùng. Môi trường đã sử dụng được thu thập ba ngày sau đó vào ngày thứ 10 và albumin tích lũy được đo bằng Xét nghiệm albumin người MSD R-PLEX. Các organoid cũng được thu thập vào ngày thứ 10 và phân giải để (E) đánh giá khả năng sống bằng Xét nghiệm khả năng sống tế bào 3D CellTiter-Glo® (CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay) (Promega). Cả hai dòng organoid gan biệt hóa đều cho thấy sự sụt giảm đáng kể albumin tiết ra khi điều trị bằng nồng độ thuốc cao, tương ứng với sự giảm khả năng sống của tế bào (giá trị trung bình từ 2 thí nghiệm). Error bars = SD. One-way ANOVA với phương pháp Tukey được sử dụng để kiểm tra thống kê (* hoặc # biểu thị P < 0,05, ** hoặc ## biểu thị P ≤ 0,01, *** hoặc ### biểu thị P ≤ 0,001, **** biểu thị P ≤ 0,0001). 

 Hình 12. Các organoid gan sơ cấp nhạy cảm với độc tính gan do thuốc gây ra phụ thuộc vào liều lượng

Các cơ quan gan đang tăng sinh và biệt hóa được xử lý bằng (A) troglitazone, (B) ketoconazole, (C) rifampicin, (D) acetaminophen hoặc chất đối chứng DMSO 1% trong 3 ngày, với các thay đổi môi trường đầy đủ chứa các hợp chất mới sau mỗi 24 giờ. Khả năng sống của tế bào được đánh giá 24 giờ sau lần bổ sung hợp chất cuối cùng bằng Xét nghiệm khả năng sống của tế bào CellTiter-Glo® 3D (Promega) và các giá trị IC50 đã được xác định. Các đường cong khả năng sống đáp ứng liều lượng thuốc này đã được so sánh với các tế bào HepG2 được xử lý tương tự và các tế bào gan người sơ cấp (PHH) được nuôi cấy trong 2D. Error bars = SD.

 Hình 13. Bộ dụng cụ HepatiCult™ Organoid hỗ trợ sự phát triển và biệt hóa của các organoid gan heo

Các organoid gan lợn được thiết lập trong môi trường khởi đầu HepatiCult™ Organoid, và sau đó được mở rộng trong 4 lần cấy trong (A) Môi trường phát triển HepatiCult™ Organoid (Người) và biệt hóa trong (B, C) Môi trường biệt hóa HepatiCult™ Organoid (Người). Các cơ quan được nhuộm bằng chất đánh dấu protein basolateral p120 (màu xanh lá cây), chất đánh dấu màng đỉnh và ống mật F-Actin (màu tím) và thuốc nhuộm hạt nhân Hoechst (màu xanh lam). (D) Độ phóng đại của Bảng C cho thấy sự hình thành ống mật như được nhìn thấy qua nhuộm F-Actin. Thanh tỷ lệ = 50 μm. Dữ liệu được sử dụng với sự cho phép của Tiến sĩ Amy Engevik (Trung tâm Y tế Đại học Vanderbilt).

Thông tin đặt hàng