Làm thế nào để đông lạnh và rã đông tế bào hiệu quả?

Blog Tháng 5 31, 2024

Quá trình đông lạnh và rã đông tế bào đóng vai trò then chốt trong nuôi cấy tế bào, vì nó quyết định trực tiếp tỷ lệ sống và khả năng sống/ hoạt tính sinh học của tế bào. Điều này ảnh hưởng trực tiếp đến độ tin cậy và tính thành công của các thí nghiệm tế bào học tiếp theo. Để đảm bảo hiệu quả tối ưu của quy trình đông lạnh và rã đông tế bào, cần tuân thủ nguyên tắc cốt lõi sau: đông lạnh chậm – rã đông nhanh (slow freezing – rapid thawing).

Đông lạnh chậm và rã đông nhanh?

Khi tế bào bị làm lạnh, các tinh thể băng hình thành cả bên trong và bên ngoài tế bào. Nếu tế bào được đưa trực tiếp vào nitơ lỏng ở -196℃, môi trường ngoại bào sẽ đóng băng trước, làm tăng dần nồng độ dung dịch bên ngoài tế bào. Điều này dẫn đến sự gia tăng nồng độ chất điện giải (electrolytes), thay đổi áp suất thẩm thấu, gây mất nước và biến tính protein. Những biến đổi này có thể gây tổn thương cơ học lên cấu trúc tế bào, làm suy giảm tính toàn vẹn (cell integrity).

Trong quá trình đông lạnh bảo quản tế bào, nước ở môi trường ngoại bào đóng băng trước. Tốc độ làm lạnh khác nhau sẽ gây ra mức độ co rút tế bào khác nhau do hiện tượng mất nước thẩm thấu (osmotic dehydration). Khi nước kết tinh thành băng, áp suất thẩm thấu của môi trường ngoại bào tiếp tục tăng. Nếu tốc độ làm lạnh quá chậm, nước trong tế bào có nhiều thời gian khuếch tán ra ngoài theo cơ chế thẩm thấu, dẫn đến mất nước quá mức và gây chết tế bào (A). Ngược lại, nếu làm lạnh quá nhanh (C), nước bên trong tế bào không kịp thoát ra ngoài, tạo thành tinh thể băng nội bào (intracellular ice formation), làm tế bào chết khi được làm ấm trở lại. Tốc độ làm lạnh trung gian (B) giúp cân bằng giữa nguy cơ mất nước thẩm thấu và sự hình thành tinh thể băng nội bào, từ đó thường đạt được tỷ lệ sống sót cao nhất.

Hình 1: Ảnh hưởng của tốc độ đông lạnh đến khả năng sống của tế bào

Ảnh hưởng của tốc độ đông lạnh đến khả năng sống của tế bào [1]

Khi bổ sung chất bảo vệ đông lạnh (cryoprotectant) như DMSO (dimethyl sulfoxide) vào môi trường đông lạnh, chất này giúp hạ điểm đóng băng và ổn định áp suất thẩm thấu của tế bào. Việc bổ sung DMSO làm giảm hiện tượng co rút do mất nước trong quá trình làm lạnh chậm, hạn chế sự hình thành tinh thể băng và do đó giảm tổn thương tế bào [1].

Khuyến nghị cho quy trình đông lạnh tế bào

Khi hồi phục tế bào, cần tăng nhiệt độ nhanh và pha loãng môi trường trong vòng 1–2 phút. Ở thời điểm này, chưa có sự hình thành đáng kể của tinh thể băng bên trong hoặc bên ngoài tế bào, và tế bào cũng chưa bị phơi nhiễm lâu với dung dịch điện giải nồng độ cao. Các biện pháp này giúp hạn chế tổn thương tế bào và tăng tỷ lệ sống sót. 

Thời điểm tối ưu để tiến hành đông lạnh tế bào là khi nào? Nồng độ tế bào phù hợp là bao nhiêu? Thể tích môi trường bảo quản đông lạnh nên sử dụng bao nhiêu? Và làm thế nào để đảm bảo quy trình “đông chậm” đúng kỹ thuật? Vui lòng tham khảo bảng bên dưới.

Khoảng thời gian tối ưu
  • Các tế bào đang ở pha tăng trưởng lũy thừa (logarithmic/exponential growth phase), có tình trạng sinh lý tốt và đã cho kết quả thí nghiệm ổn định là đối tượng tối ưu để tiến hành đông lạnh bảo quản.
  • Khuyến nghị nên bắt đầu đông lạnh tế bào trong vòng hai tuần kể từ khi hồi phục (revival), đồng thời giữ lại một phần tế bào để tiếp tục nuôi cấy phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo khi cần thiết.
Môi trường bảo quản đông lạnh
  • Môi trường bảo quản đông lạnh (cryopreservation medium) nên được pha mới ngay trong ngày tiến hành thí nghiệm. Công thức tiêu chuẩn thường theo một trong hai tỷ lệ: 7:2:1 giữa môi trường nuôi cấy (culture medium), huyết thanh (serum) và DMSO; hoặc 9:1 giữa huyết thanh và DMSO.
  • DMSO (dimethyl sulfoxide) được sử dụng phổ biến như một chất bảo vệ đông lạnh (cryoprotectant), với nồng độ 5–10% thường đủ để bảo quản phần lớn các loại tế bào. Do DMSO có tính hút ẩm (hygroscopic), cần bảo quản trong môi trường khô ráo và tránh sử dụng DMSO đã mở nắp quá một năm.
  • Việc bổ sung huyết thanh vào môi trường đông lạnh giúp tăng khả năng phục hồi tế bào sau rã đông. Tuy nhiên, do xu hướng ngày càng sử dụng môi trường nuôi cấy không chứa huyết thanh (serum-free culture media), trong một số trường hợp cần đông lạnh tế bào mà không sử dụng huyết thanh. Khi đó, các môi trường cryopreservation không huyết thanh có sẵn trên thị trường là một giải pháp thay thế phù hợp.
Nồng độ tế bào
  • Nồng độ tế bào (Cell concentration) được khuyến nghị khoảng 1 × 10⁶ tế bào/mL. Tùy thuộc vào từng loại tế bào cụ thể, giá trị này có thể dao động từ 5 × 10⁵ đến 1 × 10⁷ tế bào/mL. Việc tăng nồng độ tế bào không đồng nghĩa với việc tăng số lượng tế bào sống sau khi rã đông. Ngược lại, nồng độ quá cao có thể làm suy giảm khả năng sống (cell viability) do các tác động tích lũy bất lợi phát sinh từ mật độ tế bào lớn.
Thể tích môi trường đông lạnh tế bào
  • Lý tưởng nhất, một ống cryovial tiêu chuẩn 2 mL nên chứa 1 mL dung dịch bảo quản đông lạnh. Tránh sử dụng thể tích quá lớn cho mỗi mẫu, vì tốc độ làm lạnh không đồng đều trong toàn bộ mẫu có thể ảnh hưởng bất lợi đến khả năng sống (cell viability) của tế bào.
Tốc độ làm lạnh
  • Đối với phần lớn các loại tế bào, tốc độ làm lạnh khoảng −1°C/phút giúp bảo toàn khả năng sống (cell viability) một cách hiệu quả. Có thể sử dụng tủ đông lập trình (programmable freezers) hoặc phương pháp làm lạnh theo bậc nhiệt (gradient cooling).
  • Quy trình làm lạnh theo bậc nhiệt được khuyến nghị như sau: 4°C trong 20 phút → −20°C trong 30 phút → −80°C qua đêm → sau đó chuyển sang lưu trữ trong nitơ lỏng. 
  • Ngoài ra, có thể sử dụng các dung dịch bảo quản đông lạnh thương mại không yêu cầu thiết bị lập trình, cho phép lưu trữ trực tiếp ở −80°C.
Điều kiện lưu trữ
  • Đối với lưu trữ ngắn hạn, tế bào có thể được bảo quản an toàn ở −80°C. Tuy nhiên, đối với lưu trữ dài hạn, tế bào bắt buộc phải được lưu trữ trong nitơ lỏng. Việc bảo quản kéo dài ở −80°C có thể làm suy giảm khả năng sống (cell viability) và chức năng sinh học (cell functionality) của tế bào.
Dán nhãn và lưu hồ sơ
  • Đảm bảo ống cryovial được ghi nhãn rõ ràng với các thông tin cần thiết như: tên dòng tế bào (cell name), số thế hệ/chuyển đời (passage number hoặc generation), người thực hiện đông lạnh và ngày tiến hành đông lạnh.
  • Ngoài ra, cần ghi chép đầy đủ thông tin tế bào cùng với vị trí lưu trữ chính xác trong sổ theo dõi hoặc hệ thống quản lý mẫu. Việc quản lý hồ sơ chặt chẽ như vậy giúp đảm bảo có thể truy xuất đúng mẫu tế bào một cách thuận tiện khi cần rã đông.

Phục hồi tế bào – Khôi phục sức sống cho tế bào

Lấy tế bào (Cell Retrieval)

Cần giảm thiểu tối đa thời gian mẫu bị ấm lên thụ động từ lúc lấy ra khỏi nitơ lỏng hoặc tủ −80℃ cho đến khi đưa vào thiết bị rã đông, nhằm tránh ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng sống (cell vitality). 

Nếu vị trí lưu trữ và vị trí rã đông cách xa nhau, có thể sử dụng thùng cách nhiệt chứa đá khô (−80℃) hoặc nitơ lỏng (−196℃) để bảo quản tạm thời và vận chuyển mẫu tế bào. 

(Lưu ý: Luôn đeo kính bảo hộ và găng tay khi lấy tế bào khỏi nitơ lỏng để tránh bỏng lạnh và nguy cơ nổ ống cryovial do áp suất tăng!)

Phương pháp rã đông

a) Trong quá trình rã đông, tế bào cần được làm ấm nhanh với tốc độ tăng nhiệt khoảng 50–100℃/phút để tối đa hóa khả năng sống. Phương pháp tối ưu là sử dụng bể nước 37℃ [3]. 

Sau khi lấy ống tế bào đông lạnh khỏi nitơ lỏng hoặc tủ −80℃, nên nới lỏng nhẹ nắp ống để tránh nổ ống cryovial trong quá trình rã đông. Đặt ống vào bể nước 37℃ và lắc mạnh trong 1–2 phút cho đến khi tan hoàn toàn. 

Khuyến nghị dừng rã đông khi phần băng nhìn thấy đã tan hết nhưng mẫu vẫn còn ở trạng thái rất lạnh (~0℃). Thực hành phổ biến là lấy ống ra khỏi bể nước khi chỉ còn một mảnh băng nhỏ. Việc làm ấm đến nhiệt độ phòng hoặc cao hơn sẽ làm tăng độc tính tế bào (cytotoxicity) của chất bảo vệ đông lạnh (cryoprotectant) và làm suy giảm nghiêm trọng khả năng sống của tế bào [1]. 

b) Không khuyến khích rã đông tế bào ở nhiệt độ phòng vì có thể dẫn đến chết tế bào. 

c) Để giảm nguy cơ nhiễm tạp (contamination), cần đảm bảo miệng ống cryovial luôn ở trên mực nước trong quá trình rã đông bằng bể nước, tránh nước xâm nhập vào bên trong ống. Nước vô trùng trong bể cũng cần được thay định kỳ.

Pha loãng

Cần pha loãng tế bào càng sớm càng tốt sau khi rã đông để giảm độc tính của DMSO. Thêm môi trường nuôi cấy với tỷ lệ môi trường nuôi cấy : môi trường bảo quản đông lạnh ≥ 10:1 để pha loãng, sau đó ly tâm (centrifuge) và thay môi trường nuôi cấy mới để tái huyền phù (resuspend) tế bào. 

Quy trình này giúp giảm stress tế bào do thay đổi áp suất thẩm thấu (osmotic stress).

Thay môi trường

Tiến hành thay môi trường nuôi cấy và tiếp tục nuôi tế bào sau khi tế bào đã bám dính (cell attachment) hoặc sau 24 giờ, tùy thuộc vào tình trạng và đặc điểm sinh trưởng của dòng tế bào.

Xem thêm: Giải pháp đông lạnh và rã đông tế bào từ Biogroup

NGUỒN THAM KHẢO

How to Cryopreserve and Thaw Cells More Effectively