Làm Thế Nào Để Đông Lạnh Và Rã Đông Tế Bào Hiệu Quả?

Đào Tạo & Webinar

Làm Thế Nào Để Đông Lạnh Và Rã Đông Tế Bào Hiệu Quả?

31/05/2024 0 Bình luận

Quá trình đông lạnh và rã đông tế bào rất quan trọng trong nuôi cấy vì nó quyết định trực tiếp đến khả năng sống của tế bào. Điều này ảnh hưởng đến sự thành công của các thí nghiệm. Tuân thủ nguyên tắc thiết yếu này để đảm bảo quy trình có hiệu quả tối ưu: Đông lạnh chậm và rã đông nhanh!

“Đông lạnh chậm và rã đông nhanh”?

Trong quá trình đông lạnh, các tinh thể đá hình thành cả bên trong và bên ngoài tế bào. Khi tế bào được đông lạnh nhanh trong nitơ lỏng ở -196^oC, dung dịch ngoại bào sẽ đông lạnh trước, dần dần cô đặc dung dịch ra bên ngoài tế bào. Điều này làm tăng nồng độ các chất điện giải trong tế bào, gây ra những thay đổi về áp suất thẩm thấu, gây mất nước và gây biến tính protein. Những thay đổi như vậy có thể gây ra tổn thương cơ học cho tế bào, ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của chúng.

Trong quá trình đông lạnh, nước ở môi trường bên ngoài tế bào sẽ đóng băng. Tốc độ làm lạnh khác nhau dẫn đến mức độ tế bào co rút khác nhau do sự mất nước thẩm thấu. Áp suất thẩm thấu của môi trường bên ngoài tế bào liên tục tăng lên khi nước hình thành các tinh thể đá. Tốc độ làm lạnh càng chậm thì nước bên trong tế bào thẩm thấu ra ngoài càng lâu. Do đó, làm lạnh rất chậm dẫn đến chết tế bào do mất nước quá nhiều (A), làm lạnh nhanh (C) có thể hình thành các tinh thể đá nội bào dẫn đến tế bào bị chết khi được làm ấm. Tốc độ làm lạnh trung bình (B) giúp cân bằng nguy cơ mất nước thẩm thấu và hình thành đá nội bào, thường mang lại tỉ lệ tế bào sống tối đa (Hình 1).

Chất bảo vệ lạnh như DMSO được thêm vào môi trường bảo quản lạnh sẽ giúp hạ thấp điểm đóng băng và ổn định áp suất thẩm thấu của tế bào. Việc bổ sung này làm giảm thiểu hiện tượng co rút do sự mất nước xảy ra trong quá trình làm lạnh chậm, giảm sự hình thành tinh thể đá và ngăn ngừa tổn thương tế bào.

Khuyến cáo về bảo quản đông lạnh tế bào

Khi phục hồi, việc gia nhiệt nhanh chóng sau đó pha loãng trong vòng 1-2 phút là điều cần thiết. Tại thời điểm này, không có tinh thể đá nào hình thành bên trong hoặc bên ngoài tế bào, cũng như tế bào không tiếp xúc với dung dịch điện giải nồng độ cao trong một thời gian dài. Những biện pháp phòng ngừa này giúp tránh tổn thương tế bào và làm tăng tỷ lệ sống của tế bào.

Thời gian tối ưu để đông lạnh tế bào là gì? Nồng độ tế bào thích hợp là bao nhiêu? Nên sử dụng bao nhiêu môi trường bảo quản lạnh? Và làm thế nào chúng ta có thể đảm bảo việc "đông lạnh chậm" các tế bào? Vui lòng tham khảo bảng 1.

Thời gian đông lạnh tối ưu	Các tế bào đang trong giai đoạn tăng sinh tích cực và mật độ tế bào tăng theo cấp số nhân (Logarithmic (Log) Growth Phase), có sức sống tốt và cho kết quả thí nghiệm thành công là thời gian tối ưu cho việc đông lạnh. Nên bắt đầu đông lạnh tế bào trong vòng hai tuần sau khi phục hồi và dành một phần để nuôi cấy tiếp tục nếu cần cho các thí nghiệm tiếp theo.
Môi trường bảo quản lạnh	Môi trường bảo quản lạnh phải được chuẩn bị vào ngày thí nghiệm. Các công thức tiêu chuẩn cho môi trường này thường tuân theo tỷ lệ 7:2:1 giữa môi trường nuôi cấy và huyết thanh với DMSO hoặc tỷ lệ 9:1 giữa huyết thanh và DMSO. DMSO thường được sử dụng làm chất bảo vệ lạnh và nồng độ 5-10% là đủ để bảo quản hầu hết các loại tế bào. Vì DMSO có tính hút ẩm nên điều quan trọng là phải bảo quản nó trong môi trường khô ráo, tránh sử dụng nguồn DMSO đã mở hơn một năm. Việc đưa huyết thanh vào môi trường bảo quản lạnh giúp hỗ trợ cho việc phục hồi tế bào sau khi rã đông. Tuy nhiên, với việc sử dụng môi trường nuôi cấy không có huyết thanh, việc đông lạnh tế bào không có huyết thanh là cần thiết. Môi trường bảo quản lạnh không chứa huyết thanh có bán trên thị trường là một giải pháp thay thế trong những trường hợp như vậy.
Nồng độ tế bào	Nồng độ tế bào được khuyến nghị là khoảng 1 x 10⁶ tế bào/mL. Tùy thuộc vào loại tế bào cụ thể, nồng độ này có thể thay đổi từ 5 x 10⁵ đến 1 x 10⁷ tế bào/mL. Nồng độ tế bào cao hơn sẽ không mang lại số lượng tế bào sống cao hơn sau khi rã đông, ngược lại nó có thể vô tình làm tổn hại đến khả năng sống của tế bào do tác động tích lũy được kích thích bởi nồng độ cao.
Thể tích môi trường bảo quản lạnh	Lý tưởng nhất, một ống chứa mẫu đông lạnh tiêu chuẩn 2 mL phải chứa 1 mL dung dịch bảo quản lạnh. Tránh lưu trữ thể tích quá lớn trên mỗi mẫu, vì tốc độ làm lạnh không đồng nhất trên mẫu có thể ảnh hưởng đến khả năng sống của tế bào.
Tốc độ làm lạnh	Đối với phần lớn tế bào, tốc độ làm mát -1°C/phút có thể duy trì đáng kể khả năng sống của tế bào. Có thể sử dụng tủ lạnh đông sâu hoặc thiết bị hạ lạnh theo chương trình để hạ lạnh mẫu. Các bước làm lạnh được khuyến nghị là: 4°C trong 20 phút à -20°C trong 30 phút à -80°C qua đêm à bảo quản trong nitơ lỏng. Ngoài ra, có thể sử dụng các quy trình bảo quản lạnh tế bào trực tiếp ở -80°C có trên thị trường.
Điều kiện bảo quản lạnh	Để lưu trữ ngắn hạn, tế bào có thể được bảo quản ở -80°C. Tuy nhiên, để lưu trữ lâu dài, tế bào phải được bảo quản trong nitơ lỏng. Bảo quản kéo dài ở -80°C có thể làm giảm khả năng sống và chức năng của tế bào.
Dán nhãn và lưu hồ sơ	Đảm bảo rằng ống đông lạnh được dán nhãn rõ ràng với các thông tin thích hợp như tên tế bào, thế hệ tế bào (generation), người thực hiện và ngày đông lạnh. Ngoài ra, hãy ghi lại thông tin cùng với vị trí lưu trữ vào sổ ghi chép. Việc lưu giữ hồ sơ tỉ mỉ như vậy đảm bảo rằng các tế bào có thể được lấy ra một cách thuận tiện và chính xác khi cần để rã đông.

Phục hồi tế bào – Khôi phục sức sống cho tế bào

Lấy tế bào

Giảm thiểu thời gian gia nhiệt thụ động trong quá trình lấy mẫu từ nitơ lỏng hoặc tủ đông -80°C và đặt vào thiết bị rã đông để tránh tác động đến sức sống của tế bào. Nếu khoảng cách giữa thiết bị lưu trữ và rã đông quá xa, có thể sử dụng bình vận chuyển chứa đá khô (-80°C) hoặc nitơ lỏng (-196°C) để bảo quản và vận chuyển tế bào tạm thời.

(Lưu ý: Luôn đeo kính bảo hộ và găng tay khi lấy tế bào ra khỏi nitơ lỏng để tránh bị bỏng lạnh!)

Phương pháp rã đông

Trong quá trình rã đông, tế bào cần được gia nhiệt nhanh chóng (50~100^oC/phút) duy trì khả năng sống của tế bào tối đa; cách tối ưu để đạt được điều này là sử dụng bể ổn nhiệt có nhiệt độ 37^oC. Sau khi lấy tế bào đông lạnh ra khỏi nitơ lỏng hoặc tủ lạnh -80^oC, vặn nhẹ nắp lọ để ngăn chất bảo quản lạnh vỡ ra trong quá trình rã đông. Đặt lọ vào bể ổn nhiệt 37^oC và lắc mạnh trong 1-2 phút cho đến khi tan băng.

Nói chung, nên dừng rã đông khi băng đã tan nhưng mẫu vẫn còn lạnh (~0^oC). Cách thực hiện phổ biến là lấy mẫu ra khỏi bể ổn nhiệt khi chỉ còn lại một mẩu đá nhỏ. Làm ấm đến nhiệt độ phòng hoặc cao hơn sẽ làm tăng độc tínhcủa chất bảo vệ lạnh và làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả năng sống của tế bào.

Không nên rã đông tế bào ở nhiệt độ phòng vì điều này có thể làm tế bào chết nhanh hơn.
Đảm bảo miệng của lọ chứa mẫu luôn cao hơn mực nước trong quá trình rã đông để hạn chế nhiễm. Nước vô trùng trong bể ổn nhiệt cũng cần được thay thường xuyên.

Pha loãng

Pha loãng tế bào càng sớm càng tốt sau khi rã đông để giảm độc tính của DMSO. Thêm môi trường nuôi cấy theo tỷ lệ môi trường nuôi cấy: môi trường bảo quản lạnh ≥ 10:1 để pha loãng, sau đó ly tâm và tái huyền phù tế bào trong môi trường nuôi cấy mới. Điều này có thể làm giảm căng thẳng tế bào do thay đổi áp suất thẩm thấu.