Định lượng và kiểm soát chất lượng: Các yếu tố quan trọng trong phân tích cfDNA cho ứng dụng NGS

Định lượng chính xác cfDNA là yếu tố then chốt để đảm bảo quy trình NGS thành công. Bài viết này thảo luận về việc nâng cao kiểm soát chất lượng mẫu thông qua độ nhạy và độ đặc hiệu cao của thiết bị đo huỳnh quang EzCube Fluorometer. Ngoài ra, bài viết còn cung cấp các hướng dẫn thực tiễn về cách tích hợp EzCube và máy quang phổ vi thể tích EzDrop (EzDrop Micro-Volume Spectrophotometer) vào quy trình tiền xử lý cfDNA và chuẩn bị mẫu cho giải trình tự.

Giới thiệu về cfDNA

DNA tự do trong huyết tương – cell-free DNA (cfDNA) đã cho thấy tiềm năng to lớn trong các ứng dụng giải trình tự thế hệ mới (NGS), đặc biệt trong lĩnh vực y học chính xác dành cho ung thư. Nhờ khả năng theo dõi theo thời gian thực và tính chất không xâm lấn, cfDNA trở thành một công cụ quan trọng cho phân tích phân tử khối u. cfDNA có thể khắc phục vấn đề dị thể khối u (tumor heterogeneity) và cung cấp thông tin toàn diện hơn về bộ gen của khối u so với phương pháp sinh thiết mô truyền thống.

Điều này giúp tăng đáng kể tỷ lệ phát hiện các biến thể di truyền có giá trị lâm sàng (actionable genetic variants), đồng thời là giải pháp thay thế hiệu quả trong trường hợp mẫu mô khan hiếm hoặc khó thu thập.

Tuy nhiên, các quy trình phân tích cfDNA vẫn gặp nhiều thách thức, chẳng hạn như tỷ lệ DNA khối u lưu hành (ctDNA) trong tổng lượng cfDNA rất thấp (chỉ từ 0,01% đến 10%). Về mặt kỹ thuật, nồng độ mẫu cfDNA thường rất thấp và dễ bị nhiễm tạp chất, làm ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả.

Để vượt qua những thách thức này, nhiều nghiên cứu đã nhấn mạnh tầm quan trọng của việc định lượng và kiểm soát chất lượng (QC) nghiêm ngặt, nhằm đảm bảo khả năng ứng dụng rộng rãi hơn trong thực hành lâm sàng.

Tại sao phân tích cfDNA bằng NGS cần tiêu chuẩn định lượng và kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt hơn?

Khi thực hiện phân tích NGS đối với cfDNA, việc đặt ra các tiêu chuẩn chặt chẽ về định lượng và kiểm soát chất lượng (QC) là điều bắt buộc, chủ yếu do đặc tính riêng biệt và những thách thức kỹ thuật của cfDNA.

Hàm lượng cfDNA trong huyết tương rất thấp (thường chỉ 2–10 ng/mL), và các đoạn DNA ngắn (DNA fragments) này dễ bị phân hủy. Nếu chất lượng mẫu không được kiểm soát chặt chẽ trong quá trình NGS, có thể dẫn đến các vấn đề sau:

• Thất bại trong xây dựng thư viện: Quá trình tạo thư viện có thể thất bại do lượng cfDNA không đủ, khiến không thể thực hiện khuếch đại PCR ở các bước tiếp theo.
• Sai số định lượng: Việc định lượng không chính xác sẽ dẫn đến sai lệch trong ước tính nồng độ thư viện. Vì cfDNA có nồng độ cực thấp (<1 ng/μL) trong khi lại có nhiều DNA nền (background DNA), nên các sai số nhỏ có thể gây thừa hoặc thiếu độ bao phủ (coverage) trong quá trình giải trình tự.
• Sai lệch dữ liệu: Mẫu cfDNA có đặc trưng chiều dài khoảng ~166 bp, đây là chỉ số quan trọng để đánh giá chất lượng mẫu. Nếu xuất hiện DNA bộ gen có trọng lượng phân tử cao (gDNA >800 bp) hoặc tạp chất khác, chúng sẽ làm giảm hiệu quả căn chỉnh trình tự (mapping efficiency), tăng tỷ lệ lặp lại, và gây sai lệch dữ liệu.

Để vượt qua những khó khăn này, quy trình xử lý cfDNA cho NGS phải đạt độ nhạy và khả năng lặp lại (reproducibility) rất cao.

Phương pháp định lượng cần có khả năng đo chính xác lượng nucleic acid cực nhỏ, đồng thời phát hiện được dấu hiệu phân hủy hoặc nhiễm tạp trong mẫu, nhằm đảm bảo dữ liệu giải trình tự đạt chất lượng cao nhất.

Mặc dù phương pháp quang phổ (spectrophotometry) truyền thống đơn giản và nhanh chóng, có thể dùng để đánh giá sơ bộ nồng độ và độ tinh khiết tổng thể, nhưng độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này không đủ đối với các mẫu cfDNA nồng độ thấp và nhạy cảm với tạp chất.

Do đó, trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu và lâm sàng, đang có xu hướng chuyển sang các phương pháp phát hiện tinh vi hơn, đặc biệt là khi kết hợp với thiết bị huỳnh quang có độ nhạy cao như EzCube Fluorometer. Loại thiết bị này không chỉ định lượng chính xác nồng độ cfDNA cực thấp, mà còn đánh giá hiệu quả tính toàn vẹn của mẫu, cung cấp kiểm soát chất lượng đáng tin cậy cho quá trình xây dựng thư viện và giải trình tự NGS, đảm bảo độ chính xác và khả năng tái lập của kết quả thí nghiệm.

Cách EzCube Fluorometer hỗ trợ xử lý chính xác mẫu cfDNA

Độ nhạy và độ chính xác cao hơn

Máy đo huỳnh quang (Fluorometer) sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang đặc hiệu liên kết với DNA/RNA, cho phép phân tích các mẫu có nồng độ cực thấp. Thiết bị thể hiện độ chính xác và khả năng lặp lại rất cao ngay cả với các mẫu có nồng độ chỉ vài picogram trên mililít. Điều này khiến EzCube đặc biệt phù hợp cho việc kiểm tra chất lượng mẫu trong các thí nghiệm NGS.

Phát hiện đặc hiệu DNA/RNA

Như đã đề cập ở trên, nếu quá trình tiền xử lý mẫu sử dụng các thuốc thử phức tạp, chúng có thể gây nhiễu phản ứng phát hiện.

Tuy nhiên, thuốc nhuộm huỳnh quang được sử dụng trong phép đo fluorimetry chỉ liên kết đặc hiệu với DNA hoặc RNA, do đó kết quả không bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của protein, muối hoặc các tạp chất khác.

Nhờ đó, thiết bị có thể phản ánh chính xác hơn nồng độ thực tế của DNA/RNA trong mẫu, giúp định lượng đáng tin cậy hơn trong kiểm soát chất lượng mẫu NGS.

Vận hành đơn giản và nhanh chóng

Máy đo huỳnh quang dễ sử dụng và thân thiện với người dùng. Chỉ cần trộn mẫu với thuốc nhuộm huỳnh quang, sau đó đưa vào thiết bị – kết quả được hiển thị chỉ sau vài giây.

Ngay cả với mẫu có nồng độ rất thấp, kết quả vẫn chính xác và đáng tin cậy. Nhờ hiệu suất và sự tiện lợi, EzCube là lựa chọn thực tiễn cho việc đánh giá chất lượng mẫu trong quy trình NGS.

Kiểm soát chất lượng kép: Sự kết hợp tối ưu giữa EzCube và EzDrop

Trong giai đoạn tiền xử lý mẫu, việc chỉ dựa vào một thiết bị duy nhất có thể chưa đủ để đánh giá toàn diện và nhanh chóng cả nồng độ lẫn độ tinh khiết của mẫu. Tuy nhiên, sự kết hợp giữa EzDrop và EzCube mang lại giải pháp hoàn chỉnh và đáng tin cậy cho đánh giá chất lượng mẫu và kết quả đầu ra sau đó.

Kết hợp EzDrop và Ezcube cho giải pháp định lượng mẫu

• EzDrop – Máy quang phổ vi thể tích (Spectrophotometer)

Là công cụ định lượng axit nucleic/protein nhanh chóng, đơn giản và kinh tế, có thể phát hiện các mẫu có nồng độ cao (ví dụ dsDNA từ 2–20.000 ng/μL) mà không cần thuốc thử.

EzDrop phù hợp cho định lượng sơ bộ và đánh giá độ tinh khiết, đồng thời phát hiện nhiễm tạp, yếu tố then chốt trong kiểm soát chất lượng mẫu (xem bảng bên dưới).

Xem thêm bài viết: So sánh hiệu năng giữa máy đo quang phổ vi thể tích EzDrop 1000 và máy NanoDrop One (2000), DS-11

• EzCube – Máy đo huỳnh quang (Fluorometer)

Có độ nhạy cực cao (tối thiểu 0,01 ng/μL) và độ đặc hiệu vượt trội, có thể phân biệt các loại axit nucleic (dsDNA/ssDNA/RNA).

Thiết bị này yêu cầu thuốc thử huỳnh quang, nhưng được thiết kế cho các thí nghiệm vi lượng đòi hỏi độ chính xác cao, chẳng hạn như NGS hoặc qPCR.

Bảng 1. Kết hợp EzDrop và Ezcube cho giải pháp định lượng mẫu

Tính năng cho QC	Máy quang phổ vi thể tích EzDrop	Máy quang phổ huỳnh quang EzCube
Kiểm tra nhanh nồng độ	Thực hiện ngay, không cần thuốc thử	–
Định lượng chính xác dsDNA	–	Độ đặc hiệu cao
Đánh giá độ tinh khiết ((A260/280 & A260/230)	Đánh giá độ thạp nhiễm (protein, dung môi)	–
Phát hiện mẫu nồng độ thấp	Độ tin cậy hạn chế hơn (do độ dao động cao)	Độ nhạy cao (giới hạn phát hiện thấp)

Hướng dẫn ứng dụng cho quy trình cfDNA Liquid Biopsy

Nếu bạn đang thực hiện nghiên cứu NGS liên quan đến cfDNA, chúng tôi khuyến nghị tuân theo quy trình kiểm soát chất lượng mẫu dưới đây để nâng cao tỷ lệ thành công của thí nghiệm và đảm bảo chất lượng dữ liệu:

• Sử dụng máy quang phổ vi thể tích EzDrop (Spectrophotometer): Đo độ hấp thụ của mẫu tại bước sóng 260 nm để đánh giá nồng độ axit nucleic, đồng thời đo tỷ lệ tinh khiết A260/280 và A260/230 nhằm đảm bảo mẫu đạt tiêu chuẩn cho các bước thí nghiệm tiếp theo.
• Sử dụng máy đo huỳnh quang EzCube (Fluorometer): Định lượng chính xác nồng độ dsDNA bằng cách kết hợp với các loại thuốc thử EzQuant phù hợp, đảm bảo mẫu đạt lượng khởi đầu cần thiết cho giai đoạn xây dựng thư viện (library construction). Phương pháp này có độ nhạy ở mức picogram (pg-level sensitivity) và có thể phân biệt rõ ràng sự khác biệt nồng độ giữa mẫu bệnh lý và mẫu bình thường.
• Sau khi xây dựng thư viện (library construction): Phân tích phân bố kích thước các đoạn DNA bằng hệ thống điện di mao quản (capillary electrophoresis system), và nếu cần, có thể xác minh nồng độ hiệu dụng bằng qPCR để đảm bảo chất lượng giải trình tự.

Quy trình khuyến nghị này có thể áp dụng cho nhiều thiết lập nghiên cứu cfDNA khác nhau, mang lại cách tiếp cận có hệ thống cho bước kiểm soát chất lượng trước giải trình tự.

Định lượng chính xác – Nền tảng cho chất lượng NGS

Mẫu cfDNA chứa nguồn thông tin sinh học (biomarker) phong phú, nhưng việc phân tích chúng là một thách thức lớn. Để đạt được kết quả giải trình tự thế hệ mới (NGS) đáng tin cậy, cần có công cụ định lượng chính xác và hệ thống kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt.

Máy đo huỳnh quang EzCube đã trở thành thiết bị chủ lực trong nghiên cứu cfDNA nồng độ thấp, nhờ độ nhạy phát hiện ở mức picogram và độ đặc hiệu vượt trội.

Khi kết hợp với máy quang phổ vi thể tích EzDrop, người dùng có thể đánh giá nhanh độ tinh khiết và tổng lượng mẫu, tạo thành bộ đôi hỗ trợ toàn diện cho kiểm soát chất lượng mẫu cfDNA.

Trong cả nghiên cứu cơ bản lẫn xét nghiệm lâm sàng, kiểm soát nghiêm ngặt giai đoạn tiền xử lý mẫu là yếu tố then chốt đảm bảo độ tin cậy của dữ liệu NGS.

Bằng cách kết hợp định lượng chính xác và đánh giá độ tinh khiết toàn diện, phương pháp này không chỉ nâng cao khả năng tái lập (reproducibility) mà còn giảm thiểu nguy cơ thất bại trong xây dựng thư viện và tối ưu chi phí giải trình tự.

Xem bài viết: Kiểm soát chất lượng axit nucleic toàn diện

NGUỒN THAM KHẢO

Blue-Ray Biotech. (n.d.). Quantification and quality control: Critical considerations for cfDNA analysis in NGS applications. https://www.blue-raybio.com/en/blog/Quantification-and-Quality-Control-Critical-Considerations-for-cfDNA-Analysis-in-NGS-Applications