Đông Lạnh Và Rã Đông Tế Bào Gốc Đa Năng: Hướng Dẫn Kỹ Thuật Và Môi Trường Khuyến Nghị

Các mẫu tế bào gốc đa năng (PSC) nuôi cấy nên được thu hoạch và đông lạnh vào giai đoạn cấy chuyền. Mỗi lọ vial chứa cụm tế bào trong 1 giếng của đĩa nuôi cấy 6 giếng. Nếu sử dụng dụng cụ nuôi cấy khác thì nên điều chỉnh thể tích môi trường cho phù hợp. 

Nên đông lạnh các cụm hay tế bào đơn lẻ? 

Hướng dẫn đông lạnh và rã đông tế bào PSC dạng cụm 

• Môi trường bảo quản lạnh CryoStor® CS10  hoặc  mFreSR™  được khuyến nghị sử dụng cho tế bào PSC được nuôi cấy trong môi trương mTeSR™1 /mTeSR™ Plus. 
• Có thể tối ưu hóa quy trình đông lạnh để tạo ra các cụm tế bào (> 150 µm) bằng cách: 
• Sử dụng pipet huyết thanh 2 mL 
• Giảm thời gian ủ enzyme phân tách xuống ~1 – 2 phút và hạn chế việc cạo nếu sử dụng dung dịch Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR). 
• Giảm thời gian ủ enzyme xuống ~1 – 2 phút nếu sử dụng ReLeSR™ 
• Khi rã đông, nghiền nhẹ các cụm có kích thước lớn hơn trước khi trải vào đĩa nuôi cấy để tạo thành các cụm có kích thước 50 µm. 
• Nếu quan sát thấy một số khuẩn lạc không phân chia sau khi rã đông thì chỉ cần chọn những khuẩn lạc này và chuyển qua giếng có cùng kích thước trên đĩa mới đã được phủ (coating). 

Hướng dẫn đông lạnh và rã đông tế bào PSC dạng tế bào đơn lẻ 

• Môi trường bảo quản lạnh FreSR™-S  được khuyên dùng 
• Sử dụng ACCUTASE™  hoặc GCDR  để tách tế bào đơn 
• Đông lạnh 1 x 106 tế bào/lọ vial, sử dụng quy trình hạ lạnh có kiểm soát tốc độ. 
• Cấy chuyền các tế bào ES/iPS của người dưới dạng cụm, vì việc cấy chuyền tế bào đơn nối tiếp có thể làm tăng nguy cơ bất thường về nhiễm sắc thể. 

Hướng dẫn chung cho việc đông lạnh và rã đông PSC 

Đông lạnh 

• Làm lạnh môi trường bảo quản trước khi bắt đầu phân tách 
• Thành phần trong mỗi giếng của đĩa nuôi cấy 6 giếng được bảo quản trong 1 lọ vial (có thể thay đổi tùy thuộc vào mật độ nuôi cấy) 
• Đông lạnh 1 x 10 6 tế bào/lọ vial 
• Cấy chuyền các tế bào ES/iPS của người ở dạng cụm, vì việc cấy chuyền tế bào đơn nối tiếp có thể làm tăng nguy cơ bất thường về nhiễm sắc thể. 

Rã đông 

• Làm ấm tế bào nhanh để rã đông và khử trùng bề mặt chai/lọ bằng cồn 70 hoặc isopropanol. 
• Khi chỉ còn lại một viên đá nhỏ, chuyển tế bào vào ống falcon mới bằng pipet 2 mL. Thêm từng giọt môi trường duy trì tế bào PSC vào falcon để tránh sốc thẩm thấu và cải thiện khả năng phục hồi của tế bào. 
• Tế bào rã đông được chuyển sang nuôi cấy với môi trường mTeSR™1/mTeSR™ Plus hoặc TeSR™. 
•  Mỗi lọ vial đông lạnh được chia vào 1-2 giếng đã được phủ (coating) của đĩa nuôi cấy 6 giếng (tùy thuộc vào số lượng cụm hoặc tế bào đơn lẻ được đông lạnh) 
• Lần cấy chuyền đầu tiên sau khi rã đông có thể được yêu cầu sớm hơn dự kiến. Các tế bào có khuynh hướng cụm lại với nhau. Sau mỗi lần cấy chuyền với mật độ thích hợp, hình thái sẽ được phục hồi. 

Khi nào nên sử dụng chất ức chế ROCK (Y-27632) 

Đối với tế bào đơn 

• Thêm vào môi trường nuôi cấy tế bào đơn trong 24 giờ sau khi rã đông 

Đối với cụm tế bào 

• Có thể thêm vào môi trường nuôi cấy cụm tế bào trong 24 giờ sau khi rã đông. Phương pháp này không được khuyến nghị vì nó có thể làm tăng mật độ trải tế bào, buộc phải cấy chuyền sớm hơn mức tối ưu hoặc có thể dẫn đến việc phát triển quá mức hoặc các vấn đề khác. 
• Giúp tập hợp các cụm ES/iPS của người, nhưng không cần thiết. 

Sản phẩm STEMCELL dành cho nuôi cấy, đông lạnh và rã đông PSC 

Nguồn | STEMCELL Technologies