Chuẩn hóa protein tổng số bằng công nghệ stain-free & máy chụp ảnh gel Uvitec

Giới thiệu

Trong phương pháp lai Western Blot, quá trình chuẩn hóa cho phép điều chỉnh một cách toán học các nồng độ của protein mục tiêu đối với protein đối chứng nội, và được dùng như một chất chỉ thị về lượng protein mẫu.

Quy trình này đại diện cho một bước quan trọng và được yêu cầu phải hiệu chỉnh đối với sự thay đổi của lượng mẫu nạp, do đó xác nhận rằng những thay đổi khi quan sát được thể hiện sự khác biệt thực tế giữa các mẫu.

Các protein đối chứng (protein house keeping) thường được sử dụng để kiểm soát lượng mẫu nạp cho quá trình chuẩn hóa Western blot. Tuy nhiên, trong một số điều kiện thí nghiệm, rất khó để phát hiện ra một loại protein đối chứng tốt, đặc trưng bởi một biểu hiện ổn định. Vì lý do này, việc chuẩn hóa có thể được tính toán trên lượng protein tổng số cho mỗi mẫu được định lượng bằng cách sử dụng gel TGX Stain-free^TM.

Các điều thí nghiệm

• Để phát hiện ảnh hưởng của kháng sinh beta-lactam đối với sự biểu hiện của chất vận chuyển glutamate GLT-1 trong tế bào thần kinh đệm (tế bào hình sao) được nuôi cấy, các tế bào (120.000 tế bào/giếng đối với đĩa 12 giếng) được xử lý trong DIV20 (20 ngày nuôi cấy in vitro) với liều lượng thuốc tăng dần sau 48 giờ.

• Thuốc được hòa tan trong nước, thêm vào môi trường nuôi cấy (DMEM-HAM F10, 10% FBS, 1% Pen/Strep).

• Tế bào hình sao được ly giải bằng cách sử dụng dung dịch đệm Laemmli (50 μl/giếng cho đĩa 12 giếng) và đun sôi ở 95°C trong 3 phút.
• 15 µl dịch phân giải protein, tương ứng với 15 µg protein, được nạp vào 4-15% CriterionTM TGX^TM Protein Midi Precast Gel (Bio-Rad) và chạy ở hiệu điện thế không đổi 200V.
• Sau khi phân tách điện di, gel được đặt trực tiếp trên hộp đèn soi gel UV-transilluminator (máy chụp ảnh gel ESSENTIAL V6 của Uvitech, Anh) và được kích hoạt trong 60 giây (Hình 1). Sau đó, các protein được chuyển trên màng lai nitrocellulose bằng cách sử dụng thiết bị chuyển màng lai bán khô (Trans-blot SD, Bio-Rad).
• Màng lai được ủ 1 giờ trong dung dịch đệm (nước muối đệm Tris chứa 0,1% Tween-20 (TBS-T) và 5% sữa khô không béo), và sau đó ủ qua đêm (4°C) với kháng thể sơ cấp kháng GLT1 (Santa Công nghệ sinh học Cruz, tỷ lệ 1:500 trong sữa 5% TBS-T).
• Sau ba lần rửa với dung dịch đệm TBS-T, các vạch màu được ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng với kháng thể thứ cấp kháng chuột gắn enzyme HRP (1:10000 trong 5% sữa trong TBS-T) và các đơn vị miễn dịch được phát hiện bằng cách sử dụng bộ cơ chất ECL (GenSpin, Milan, Ý) và được chụp trên máy chụp ảnh gel ALLIANCE MINI HD9 (Uvitech, Anh).
• Các phép đo thể tích dãy GLT-1 được thực hiện bằng phần mềm Uvitec và giá trị được chuẩn hóa cho vạch TGX tương ứng. Phép trừ nền được thực hiện bằng cách chọn "rolling ball" cho tất cả các phép đo. Giá trị trung bình của nhóm không được xử lý (đối chứng) được đặt ở 100% và dữ liệu được biểu thị bằng phần trăm kiểm soát.

Kết luận

Kháng sinh beta-lactam được chọn làm tăng sự biểu hiện của GLT-1 trong tế bào hình sao được nuôi cấy theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 2)

Hình 1. Hình ảnh Gel không vết bẩn TGX sau khi kích hoạt tia cực tím.

Các mẫu được chỉ định trên mỗi dải. C = đối chứng, 10 = 10µM, 100 = 100µM, 500 = 500µM của kháng sinh beta-lactam. Sau khi phân tách điện di, gel được đặt trực tiếp trên UV-transilluminator (Hệ thống ESSENTIAL V6, UVITEC Ltd, Anh) và được kích hoạt trong 60 giây

Hình 2. Tín hiệu hóa phát quang của GLT-1 Sau phản ứng ECL.

Các mẫu được chỉ định trên mỗi dải. C = đối chứng, 10 = 10µM, 100 = 100µM, 500 = 500µM của kháng sinh beta-lactam. Kháng sinh beta-lactam được chọn làm tăng sự biểu hiện của GLT-1 trong tế bào hình sao được nuôi cấy theo cách phụ thuộc vào liều lượng.