Cách Đếm Tế Bào Bằng Hemocytometer

Đếm tế bào là một phần không thể thiếu trong việc xác định nồng độ tế bào để cấy trong môi trường nuôi cấy, xác định khả năng sống của tế bào và đánh giá kết quả của quy trình phân lập tế bào. Nên thực hiện đếm tế bào ban đầu trước khi phân lập tế bào; con số này sau đó có thể được so sánh với số lượng tế bào sau khi phân lập tế bào để tính toán khả năng phục hồi tế bào. Ngoài ra, việc đếm tế bào sống nên được thực hiện khi tỉ lệ tế bào sống có thể giảm, ví dụ như khi tế bào bảo quản đông lạnh hoặc thao tác bên ngoài cơ thể sống (ex vivo).

Việc đếm tế bào có thể được thực hiện bằng thuốc nhuộm Trypan Blue hoặc 3% Acetic Acid với Methylene Blue. Khi thực hiện đếm tổng số tế bào có nhân, nên sử dụng 3% Axit axetic với Methylene Blue. Axit axetic đi xuyên qua màng tế bào và màu xanh metylen nhuộm các nhân của tế bào khi tiếp xúc. Vì các tế bào hồng cầu trưởng thành không có nhân nên chúng bị loại ra khi đếm. Ngoài ra, Trypan Blue được khuyên dùng để đếm các tế bào sống của động vật có vú. Trypan Blue xuyên qua màng tế bào, do đó nó xâm nhập vào tế bào chất của các tế bào có màng bị tổn thương (tế bào chết) để nhuộm chúng thành màu xanh lam. Các tế bào sống vẫn còn nguyên vẹn và có thể được phân biệt với các tế bào chết nhờ khả năng loại bỏ thuốc nhuộm màu xanh lam của chúng. Trong trường hợp này, người ta sẽ đếm các tế bào còn nguyên vẹn.

Giao thức này mô tả cách thực hiện đếm tổng số tế bào có nhân bằng Axit axetic 3% với Methylene Blue và cách thực hiện đếm tế bào sống bằng cách loại trừ thuốc nhuộm Trypan Blue.

Nguyên vật liệu

• Axit axetic 3% với Methylene Blue (Catalog #07060) hoặc Trypan Blue (Catalog #07050)

• Đĩa 96 giếng (ví dụ: Đĩa Corning^®96 giếng đáy tròn, Catalog #38018) hoặc tube ly tâm (ví dụ: Costar^® Microcentrifuge Tubes, Catalog #38090)

• Buồng đếm hồng cầu và nắp đậy (ví dụ: Hausser Scientific™ Bright-Line Hemocytometer, Catalog #100-1181)

• Ethanol 70%

• Pipettor (ví dụ: Pipettor Corning^® Lambda™ Plus, Catalog #38060)

  • Đầu tip pipet (ví dụ: Đầu tip pipet có lọc Corning^®, Catalog #38034)

Quy trình

Phần I: Chuẩn bị mẫu

Tùy chọn 1: Pha loãng tế bào bằng axit axetic 3% với Methylene Blue để đếm tổng số tế bào có nhân

1. Chuẩn bị dung dịch huyền phù tế bào đơn bằng cách sử dụng dung dịch muối đệm phốt phát (PBS) hoặc môi trường không chứa huyết thanh. Để lấy mẫu đại diện chính xác, sử dụng ít nhất 20 µL huyền phù tế bào để pha loãng.

Ví dụ: Chuẩn bị dung dịch pha loãng 10 lần

a.Thêm 180 µL Axit Axetic 3% với Methylene blue vào tube ly tâm hoặc giếng của đĩa 96 giếng.

b.Trộn huyền phù tế bào và hút 20 µL dịch huyền phù vào ống hoặc giếng chứa 3% Acetic Acid với Methylene Blue.

Tùy chọn 2: Pha loãng tế bào bằng cách loại trừ thuốc nhuộm Trypan Blue để đếm tế bào sống

1. Đảm bảo rằng tế bào được huyền phù hoàn toàn. Trước khi các tế bào lắng xuống, hút một thể tích phù hợp của huyền phù tế bào (20 - 200 μL) vào ống ly tâm.

2. Thêm một lượng thể tích Trypan Blue 0,4% tương đương, trộn nhẹ nhàng.

3. Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng (15°C – 25°C) trong 5 phút.

Phần II: Đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu

1. Chuẩn bị buồng đếm bằng cách làm sạch bề mặt buồng đếm bằng cồn 70%. Lau khô. Đặt nắp đậy trên buồng.

2. Huyền phù lại hỗn hợp tế bào và hút 10 μL tế bào đã nhuộm màu vào buồng đếm.

Lưu ý: Cẩn thận không di chuyển nắp. Mẫu sẽ được mao dẫn vào buồng đếm.

3. Đặt buồng đếm  trên vị trí đếm của kính hiển vi. Điều chỉnh kính hiển vi ở độ phóng đại 10 lần và chỉnh lấy nét vào các tế bào.

4. Sử dụng máy đếm thứ tự, đếm các tế bào (nhân đã nhuộm màu) ở mỗi trong số bốn ô vuông bên ngoài của buồng đếm (Hình 1A), bao gồm các tế bào nằm ở cạnh phía dưới và  cạnh bên trái, nhưng không bao gồm các tế bào nằm ở cạnh phía trên và cạnh bên phải (Hình 1B). Nếu Axit axetic 3% với Methylene Blue được sử dụng trong Phần I, hãy đếm số nhân tế bào đã nhuộm màu. Nếu Trypan Blue đã được sử dụng trong Phần I, hãy đếm các tế bào sống không nhuộm màu.

Hình 1. Đường lưới của buồng đếm hồng cầu: Sơ đồ buồng đếm biểu thị (A) bốn ô đếm màu đỏ và (B) 16 ô vuông ở một trong 1 ô lớn

Lưu ý: Hệ số pha loãng thích hợp sẽ phụ thuộc vào số lượng tế bào gần đúng có trong mẫu ban đầu, nhưng nên pha loãng để mật độ tế bào đạt 50 - 100 tế bào trên mỗi ô vuông (ô vuông lớn hoặc ô vuông chính) trong buồng đếm. Nếu có nhiều hơn hoặc ít hơn khoảng 100 tế bào trên mỗi ô vuông chính trên buồng, hãy chuẩn bị một mẫu đã pha loãng mới bằng cách sử dụng hệ số pha loãng lớn hơn hoặc nhỏ hơn.

5. Mỗi ô trong chín ô vuông chính của buồng đếm có tổng thể tích là 0,1 mm³. Vì 1 cm³ tương đương với 1 mL, nồng độ tế bào có thể được xác định bằng phương trình sau:

Tổng số tế bào có nhân/mL = số tế bào trung bình trên mỗi ô vuông x hệ số pha loãng x 10⁴

Ví dụ: Nếu số lượng tế bào cho mỗi trong bốn ô vuông bên ngoài là 21, 15, 20 và 17 ở hệ số pha loãng 100 thì số lượng tế bào trung bình sẽ là (21 + 15 + 20 + 17) ÷ 4 = 18,25.

Do đó, nồng độ tế bào trong huyền phù ban đầu sẽ là: 18,25 x 100 x 10^4 = 18.250.000 tế bào/mL.