Quy Trình Xử Lý Máu Cuống Rốn Thủ Công

Quy trình vận hành chuẩn SOP bao gồm các quá trình thu thập, xử lý và lưu trữ máu cuống rốn là kết quả nghiên cứu ghép tế bào gốc máu cuống rốn (COBLT - Cord Blood Stem Cell Transplantation Study) do các ngân hàng máu cuống rốn (Cord Blood Banks - CBB) và các trung tâm huyết học phát triển năm 1998 tại Mỹ. Quy trình này đang được dùng rộng rãi ở các ngân hàng máu cuống rốn và các trung tâm huyết học trên thế giới.

Máu cuống rốn là gì?

Máu cuống rốn có khả năng cứu mạng sống. Khi lớn lên trong bụng mẹ, dây rốn của trẻ sơ sinh cung cấp cho em bé máu giàu chất dinh dưỡng từ nhau thai để đang tăng trưởng. Máu tìm thấy trong dây rốn được gọi là máu cuống rốn. Máu cuống rốn là một nguồn tế bào gốc tạo máu (HSC) phong phú có khả năng tự nhân đôi và phát triển thành các loại tế bào chuyên biệt khác. Điều này làm cho chúng trở thành lựa chọn lý tưởng để sử dụng trong ghép tế bào gốc, một loại liệu pháp tế bào trong y học tái tạo để điều trị bệnh.

Máu cuống rốn hiện được FDA Mỹ chấp thuận để điều trị gần 80 bệnh, và phương pháp điều trị bằng tế bào gốc máu cuống rốn đã được thực hiện hơn 35.000 ca trên toàn cầu để điều trị ung thư (bao gồm ung thư hạch bạch huyết và ung thư máu), bệnh thiếu máu não và rối loạn chuyển hóa di truyền. Các nhà nghiên cứu cũng đang khám phá tác dụng của máu dây rốn có khả năng điều trị bệnh thiếu máu não và giảm viêm, điều này có thể là cách điều trị cho các bệnh chưa có phương pháp điều trị hiệu quả cho đến thời điểm này.

Quy trình vận hành chuẩn (SOP) thu thập, xử lý và lưu trữ máu cuống rốn

Quy trình vận hành chuẩn SOP bao gồm các quá trình thu thập, xử lý và lưu trữ máu cuống rốn là kết quả nghiên cứu ghép tế bào gốc máu cuống rốn (COBLT - Cord Blood Stem Cell Transplantation Study) do các ngân hàng máu cuống rốn (Cord Blood Banks - CBB) và các trung tâm huyết học tại Mỹ phát triển từ tháng 10 năm 1996 đến tháng 7 năm 1998. Các quy trình lâm sàng được thực hiện với đơn vị tế bào gốc (CBU - Cord Blood Unit) và được công bố vào tháng 10 năm 1998.

Quy trình này đang được sử dụng rộng rãi ở hầu hết các ngân hàng xử lý máu cuống rốn thủ công trên thế giới. Quy trình vận hành SOP thu thập và xử lý máu cuống thủ công được trình bày bên dưới chỉ mang tính chất tham khảo và được hoàn thiện theo thời gian và theo điều kiện thực tế của từng ngân hàng máu cuống rốn.

 

Thu thập mẫu máu cuống rốn

Máu cuống rốn sẽ được bác sĩ sản khoa hoặc điều dưỡng có kinh nghiệm thu thập ở điều kiện vô trùng ngay tại phòng sinh/ phòng mổ. Khi thu mẫu, máu chảy từ dây cuống rốn vào bộ túi thu thập máu cuống rốn có chứa sẵn chất chống đông máu. Thời gian thu thập máu cuống rốn được diễn ra nhanh chóng, chỉ khoảng 5 phút sau khi em bé ra đời.

Quy trình vận chuyển, nhận mẫu & nhập dữ liệu máu cuống rốn

MCR sau khi thu thập sẽ được vận chuyển đến Ngân hàng máu cuống rốn để tiến hành xử lý. Toàn bộ quy trình được thực hiện nghiêm ngặt theo quy trình chuẩn SOP để đảm bảo độ chuẩn xác và chất lượng mẫu tế bào gốc máu cuống rốn như:

1. Xác nhận các thông số cần thiết (ngày, giờ, tổng số MCR đã nhận, nhiệt độ, ID). Các mẫu máu cuống rốn khi vận chuyển được bảo quản ở nhiệt độ từ 4°C đến 37°C.
2. Xác định nhãn mã vạch và các hồ sơ liên quan kèm theo của từng mẫu máu cuống rốn.
3. Lưu tất cả thông tin liên quan vào cơ sở dữ liệu của ngân hàng máu cuống rốn và phải bảo quản an toàn.
4. Kiểm tra túi thu thập máu cuống rốn xem có bị rò rỉ và nhãn mã vạch còn nguyên vẹn của hay không? Thể tích mẫu máu cuống rốn phải trên 30 ml và không để lâu hơn 48 giờ kể từ khi thu nhập mẫu.

Quy trình xử lý máu cuống rốn thủ công

Đây là phương pháp xử lý tế bào gốc máu cuống rốn phổ biến tại các ngân hàng tế bào gốc, thực hiện bằng tay bởi các kỹ thuật viên phòng lab.

Xử lý máu cuống rốn thủ công là quá trình làm giảm thể tích máu cuống rốn và loại bỏ tế bào hồng cầu bằng dung dịch HES (HydroxyEthyl Starch). Dung dịch HES có chức năng là một chất hỗ trợ lắng tế bào hồng cầu trong quá trình làm giảm thể tích, giảm lượng tế bào hồng cầu trong mẫu tế bào gốc tạo máu (hematopoietic stem cell) bằng phương pháp ly tâm.

Thiết bị, dụng cụ

• Tủ an toàn sinh học cấp II.
• Máy ly tâm túi máu.
• Máy hàn dây túi máu cuống rốn (hàn được vật liệu EVA (ethylene vinyl acetate)).
• Dụng cụ Sealing Jig (có chức năng định dạng chính xác các vị trí hàn dây, túi đông lạnh 25 mL một cách an toàn).
• Bàn ép huyết tương (bàn ép túi máu tự động điều chỉnh thể tích).
• Máy hàn túi bao ngoài (túi overwrap) (máy có chức năng đẩy nhanh khí ra ngoài và hàn kín túi overwrap bằng vật liệu FEP (fluorinated ethylene propylene)).

Hóa chất, vật tư

• Dung dịch SedimSure HES 600.
• Bộ túi xử lý máu cuống rốn thủ công (manual transfer/ freezing bag set).
• Dụng cụ lấy mẫu (spike adaptor).
• Nhãn mã vạch (barcode label) (chịu được nhiệt độ động sâu -196^oC).
• Dung dịch DMSO (dùng để bảo quản đông lạnh tế bào gốc từ máu cuống rốn).
• Dung dịch Dextran 40 (dùng để bảo quản đông lạnh tế bào gốc từ máu cuống rốn).

Quy trình xử lý máu cuống rốn (MCR)

1. Kiểm tra sự tương thích mã số/ mã vạch trên túi thu thập chứa máu cuống rốn và trên các hồ sơ kèm theo.
2. Lấy mẫu test lần 1: Lấy 0,5 mL máu từ túi thu thập (Túi 1) để thực hiện các xét nghiệm.

1. Thực hiện xét nghiệm các bệnh truyền nhiểm & di truyền (có thể bỏ qua bước này, nếu đã có kết quả xét trước đó của Sản phụ): Mẫu sẽ được loại bỏ nếu dương tính với các xét nghiệm: HIV, Hemoglobin, Viêm gan B, C (các chỉ tiêu xét nghiệm theo quy định/ tiêu chuẩn của từng ngân hàng tế bào gốc khác nhau).
2. Thực hiện đếm tế bào có nhân và xác định tỷ lệ sống của tế bào: Nếu tổng thể tích máu cuống rốn (MCR + chất chống đông máu) từ 65 - 85 ml, và tổng số tế bào có nhân < 6x10⁸ tế bào → Loại bỏ mẫu MCR.
3. Kiểm tra nhóm máu ABO và Rh, kiểm tra nhiểm vi sinh (nếu cần).

3. Thêm dung dịch HES 6% vào túi thu thập (Túi 1) với tỷ lệ HES:MCR (máu + chất chống đông máu) = 1:5.
4. Kết nối vô trùng túi thu thập với bộ túi xử lý tế bào gốc (có thể kết nối trước hoặc sau bước ly tâm lần 1).
5. Ly tâm lần 1 với tốc độ ly tâm 150g trong 5 phút, ở nhiệt độ 10°C (tốc độ, nhiệt độ ly tâm của máy ly tâm khác nhau được tối ưu bởi mỗi ngân hàng máu cuống rốn sao cho thu hồi được >60% tế bào có nhân còn sống hoặc >80% tế bào đơn nhân còn sống).
6. Cẩn thận lấy cốc ly tâm ra (chứa túi thu thập và bộ túi xử lý).
7. Điều chỉnh dòng chảy bằng kẹp, chuyển từ từ phần dịch nổi ở trên (huyết tương giàu bạch cầu - leukocyte-rich plasma) chảy vào túi xử lý (Túi 2) và cân Túi 2.
8. Ly tâm lần 2 với tốc độ ly tâm 400g trong 10 phút, ở nhiệt độ 10°C (tốc độ, nhiệt độ ly tâm của máy ly tâm khác nhau được tối ưu bởi mỗi ngân hàng tế bào gốc sao cho thu hồi được > 60% tế bào có nhân còn sống hoặc > 80% tế bào đơn nhân còn sống).
9. Cẩn thận lấy cốc ly tâm (chứa bộ xử lý tế bào gốc) ra và đặt Túi 2 vào bàn ép huyết tương.
10. Huyết tương được chuyển từ Túi xử lý (Túi 2) chuyển sang túi huyết tương (Túi 3). (lượng huyết tương lấy ra được tính bằng cách trừ cho hằng số (được xác định theo yếu tố điều chỉnh của mỗi ngân hàng máu cuống rốn, ví dụ: 25 grams) sao cho lượng dung dịch hồng cầu lấy không nhiều hơn 20 grams).
11. Lấy mẫu test lần 2: từ túi xử lý (Túi 2) để thực hiện các xét nghiệm sau xử lý: MNC, TNC, CD34+, hematocrit (HCT), CFU (nếu cần).
12. Đơn vị máu cuống rốn sau khi xử lý và đạt tiêu chuẩn sẽ được thêm từ từ dung dịch bảo quản lạnh được chuẩn bị sẳn (bao gồm dung dịch DMSO 99.9% và 10% W/V Dextran 40) và được chuyển sang túi đông lạnh (Túi 4) sao cho thể tích cuối đạt khoảng 25mL. Sau đó, đơn vị tế bào gốc máu cuống rốn (CBU – Cord Blood Unit) sẽ được hạ nhiệt độ theo chương trình (CRF) và lưu trữ bằng hệ thống lưu trữ tế bào gốc tự động hoặc thủ công.

Quy trình lưu trữ các đơn vị tế bào gốc máu cuống rốn

Thiết bị, dụng cụ

Có hai phương pháp bảo quản đông lạnh tế bào gốc máu cuống rốn được mô tả như sau:

Lưu trữ tế bào gốc máu cuống rốn tự động hoàn toàn bằng hệ thống BioArchive. Hệ thống bao gồm:

• Hệ thống lưu trữ và lưu mẫu, lấy mẫu (đơn vị tế bào gốc) bằng cánh tay robot được kết hợp thành một thiết bị đồng bộ, được vận hành hoàn toàn tự động qua máy tính và phần mềm điều khiển và quản lý dữ liệu mẫu SMS. Có hai mô-đun hạ nhiệt độ theo chương trình (CRF) được tích hợp bên trong hệ thống và mô-đun lấy mẫu đông.
• Máy tính và phụ kiện (máy in, máy quét nhãn mã vạch, máy in nhãn mã vạch, chuột, bàn phím, laptop).
• Bình cấp nitơ lỏng.

Lưu trữ tế bào gốc máu cuống rốn trong bình nitơ lưu trữ mẫu thủ công, bao gồm:

• Bình nitơ lưu trữ tế bào gốc.
• Thiết bị hạ nhiệt độ theo chương trình (CRF) độc lập.
• Máy tính, máy in.
• Bình cấp nitơ lỏng.
• Bộ bảo hộ: găng tay, mắt kính, ủng, tạp dề.

Hoá chất, vật tư

• Hộp canister hoặc hộp cassette (bảo vệ túi lưu trữ tế bào gốc).
• Túi bao ngoài (túi overwrap làm bằng vật liệu Teflon FEP).

Quy trình hạ nhiệt độ theo chương trình (CRF)

• Khi sử dụng hệ thống lưu trữ BioArchive tự động: Có 2 Mô-đun CRF hạ nhiệt độ theo chương trình được tích hợp và lập trình chuẩn SOP trong hệ thống Bioarchive và đạt chuẩn cGMP đo FDA (Mỹ) phê duyệt là hệ thống thiết bị y tế.

Đặt hộp canister (chứa đơn vị tế bào gốc - CBU) vào mô-đun CRF và đặt vào cổng 1 hoặc 2 của hệ thống Bioarchive. Quá trình hạ nhiệt độ theo chương trình được lặp trình chuẩn SOP được thực hiện ngay bên trong hệ thống BioArchive (chương trình hạ nhiệt độ được khuyến nghị tốc độ hạ nhiệt trước điểm đông giảm 1 - 10^oC/phút ở khoảng hạ nhiệt từ 4^oC đến -3^oC, khi nhiệt độ bắt đầu điểm đông 0 đến -15^oC (công suất quạt 10 - 100%) và giảm 2^oC/phút cho đến nhiệt độ mục tiêu (khoảng -50^oC)). Sau đó, cánh tay robot tự động chuyển hộp canister chứa CBU vào vị trí lưu trữ được lặp trình trước trong nitơ lỏng (-196^oC) của hệ thống BioArchive. Như vậy, khi sử dụng công nghệ hiện đại của hệ thống BioArchive lưu trữ tế bào gốc sẽ hạn chế tối đa hiện tượng gia nhiệt tam thời (TWEs), sẽ giúp đơn vị tế bào gốc đạt chất lượng cao và đạt tỷ lệ cao trong ghép tế bào gốc.

• Khi lưu trữ tế bào gốc thủ công: Thiết bị hạ nhiệt độ theo chương trình (CRF) và bình nitơ lưu trữ mẫu thủ công là hai thiết bị độc lập và là quá trình lưu mẫu được thực hiện thủ công:

Đặt hộp canister (chứa đơn vị tế bào gốc - CBU) vào ngăn lạnh của thiết bị CRF. Sau đó, lắp đầu dò nhiệt độ vào canister và bắt đầu chương trình hạ nhiệt độ (chương trình hạ nhiệt độ được lặp trình sẳn). Ban đầu tốc độ đóng băng được khuyến cáo từ 1^oC/phút đến 2^oC/phút, bắt đầu từ 4^oC đến -40^oC và 10^oC/phút sau đó đến -90^oC.

Sau quá trình hạ nhiệt độ, hộp canister đó được lấy ra khỏi thiết bị CRF và đặt vào giá đỡ canister của bình nitơ lỏng để bảo quản đơn vị tế bào gốc. Do quá trình thực hiện trên 2 thiết bị độc lập nên đã xảy ra hiện tượng gia nhiệt tam thời (TWEs), có thể ảnh hưởng đến chất lượng đơn vị tế bào gốc.