Xác Định Tế Bào Sống Bằng Phương Pháp Nhuộm Trypan Blue

Thuốc nhuộm Trypan Blue được sử dụng để xác định số lượng tế bào sống sót có trong huyền phù tế bào. Nó dựa trên nguyên lý rằng các tế bào sống có màng tế bào nguyên vẹn sẽ không bắt màu khi nhuộm xanh Trypan còn các tế bào chết sẽ bắt màu. Thông qua đếm số lượng tế bào không bắt màu và bắt màu sau khi nhuộm để tính tỷ lệ sống của tế bào.

Thiết bị và vật tư

• Máy đếm tế bào.
• Mico-Pipet
• Buồng đếm hồng cầu; lamen
• Ống Eppendorf
• Kính hiển vi quang học vật kính 10X và 40X

Hóa chất

• Cồn 70^o, nước muối
• Trypan Blue 0,4%

Quy trình

• Tổng phân tích tế bào máu
• Chuẩn bị kính hiển vi, buồng đếm gắn sẵn lamen
• Pha loãng mẫu với dung dịch nước muối sinh lý, dựa trên số lượng bạch cầu đo được đảm bảo mật độ tế bào khoảng 500 tế bào/µl là phù hợp
• Tế bào được nhuộm với dung dịch Trypan blue 0,4% theo tỷ lệ 1: 1 vể thể tích (ví dụ: 50 µl tế bào đến 50 µl trypan blue) và trộn bằng cách đẩy pipet lên xuống.
• Ủ hỗn hợp trong ít hơn ba phút ở nhiệt độ phòng. Nếu các tế bào được đếm sau khoảng năm phút, khả năng sống sót sẽ không chính xác do tế bào chết.
• Nhỏ 10µl tế bào đã nhuộm vào mép lamen để dịch mao dẫn vào trong buồng đếm
• Đọc kết quả ở vật kính 40X

• Đưa vi trường theo đường zíc - zắc để tránh đếm lặp lại các tế bào, đếm số tế bào sống và tế bào chết trong đó các tế bào chết là tế bào bị nhuộm màu xanh. Đếm tổng số ít nhất 200 tế bào  

Tính tỷ lệ tế bào sống:

                                                 Số tế bào sống

          Tỷ lệ tế bào sống = ------------------------------------- x 100%

                                          Tổng số tế bào đếm được

(Nguồn: Áp dụng theo quy trình kỹ thuật của AABB).

Tài liệu tham khảo

• Nicholas Greco, Lynn O’Donnel. Determining cellular viability using Trypan blue. Cellular Therapy: Principle, Method and Regulation, Bethesda, MD: AABB, 2009, chapter 47, Method 47 - 1. p.565 - 566.