Cách nuôi tăng sinh tế bào T trong hệ thống nuôi tăng sinh G-Rex® bằng phương pháp nuôi cấy hạn chế can thiệp

Tế bào T là trọng tâm của nhiều chiến lược liệu pháp miễn dịch tế bào nuôi nhận. Vì vậy, việc sở hữu các giải pháp kích hoạt và tăng sinh tế bào mạnh mẽ, dễ dàng mở rộng quy mô là yếu tố then chốt trong nghiên cứu, tối ưu quy trình và sản xuất thương mại. Phương pháp này mang đến một quy trình tinh gọn, hạn chế tối đa thao tác thủ công khi tăng sinh tế bào T nhờ sự kết hợp giữa các thuốc thử ImmunoCult™ đạt chuẩn GMP và hệ thống nuôi tăng sinh G-Rex®. Việc giảm thiểu số lần can thiệp tạo tiền đề thuận lợi
để bổ sung hoạt chất kích hoạt và điều chỉnh mật độ tế bào, giúp đạt hiệu suất tăng sinh tối ưu mà vẫn bảo tồn nguyên vẹn độ sống của tế bào, hoạt tính chức năng cùng các kiểu hình tế bào T ghi nhớ. Với khả năng tương thích linh hoạt cho cả mô hình scale-up và scale-out, phương pháp tiếp cận này là lựa chọn lý tưởng cho các đơn vị đang phát triển và sản xuất liệu pháp tế bào T (cả dòng biến đổi gen như CAR-T, TCR hay dòng không biến đổi gen).

Vật liệu hóa chất:

• Tế bào T người: Ví dụ tế bào được phân lập từ khối bạch cầu tươi (fresh leukopak,
  Mã số sản phẩm #70500) bằng Bộ phân lập tế bào T người EasySep™ (Catalog 17951), sử dụng ở dạng tươi hoặc bảo quản đông lạnh trong CryoStor® CS10 (Catalog #07930).
• Môi trường ImmunoCult™-XF (Catalog #100-0956)
• Tác nhân kích hoạt tế bào T người ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2 (Catalog #100-0785)
• Interleukin-2 tái tổ hợp ở người, không chứa thành phần động vật (ACF) (Human Recombinant IL-2, ACF; Catalog #78145)
• Bioreactor: Ví dụ Đĩa nuôi cấy G-Rex® 6M (ScaleReady; Catalog #80660M) hoặc Hệ thống mở G-Rex® 50M (ScaleReady; Catalog #80055).

Vật tư bổ sung: Đĩa nuôi cấy G-Rex® 24-well (ScaleReady; Catalog #80192M) hoặc tương đương để tối ưu hóa liều lượng tác nhân kích hoạt và mật độ tế bào.

Hình 1. Quy trình nuôi cấy để kích hoạt và tăng sinh tế bào T trong đĩa nuôi cấy GRex® 6M và hệ thống ở G-Rex® 50M

Tế bào T người được phân lập từ khối bạch cầu tươi (fresh leukopak; Mã danh mục #70500) của người hiến khỏe mạnh bằng Bộ phân lập tế bào T người EasySep™ (Mã danh mục #17951), và được sử dụng ngay sau phân lập hoặc sau khi bảo quản đông lạnh trong CryoStor® CS10 (Mã danh mục #07930). Tế bào T sau phân lập được cấy với mật độ 1 – 2 × 10⁶ tế bào/cm² trong tổng thể tích 10 mL (đối với Đĩa nuôi cấy G-Rex® 6M) hoặc 50 mL (đối với Hệ thống mở G-Rex® 50M) môi trường ImmunoCult™-XF (Mã danh mục #100-0956), sau đó được kích hoạt bằng 6,25 hoặc 25 µL/mL yếu tố kích hoạt tế bào T người ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2 (Mã danh mục #100-0785) có bổ sung IL-2 người tái tổ hợp (rh IL-2; Mã danh mục #78145) ở nồng độ 180 IU/mL. Vào ngày 3, các mẻ nuôi cấy trong G-Rex® được bổ sung thêm môi trường mới chứa IL-2 đến thể tích tối đa là 100 mL (Đĩa nuôi cấy G-Rex® 6M) hoặc 500 mL (Hệ thống mở G-Rex® 50M), như được trình bày trong Bảng 1. Không thực hiện thêm bất kỳ thao tác can thiệp nào cho đến thời điểm thu hoạch vào ngày 7 (nếu sử dụng Hệ thống mở G-Rex® 50M) hoặc ngày 10 (đối với Đĩa nuôi cấy G-Rex® 6M).

Quy trình thực hiện:

Vào ngày 0, cấy tế bào T phân lập sau rã đông vào Đĩa nuôi cấy G-Rex® 6M hoặc Hệ thống mở G-Rex® 50M với mật độ 0,5 – 2 × 10⁶ tế bào/cm². Kích hoạt tế bào T bằng Tác nhân kích hoạt tế bào T người ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2 ở nồng độ 6,25 – 25 µL/mL trong môi trường ImmunoCult™-XF có bổ sung rh IL-2 người tái tổ hợp chuẩn ACF (180 IU/mL; tương đương 10 ng/mL). Sử dụng thể tích nuôi cấy khởi đầu được khuyến nghị như trình bày trong Bảng 1.

Lưu ý: Mật độ nuôi cấy tối thiểu được khuyến nghị là 0,5 × 10⁶ tế bào/cm². Chuẩn độ yếu tố bổ sung kích hoạt tế bào T người ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2 để xác định nồng độ tối ưu cho quy trình (Hình 2).

Bảng 1. Các thiết lập nuôi cấy được khuyến nghị cho hệ thống nuôi cấy G-Rex®

Vào ngày 3, bổ sung môi trường ImmunoCult™-XF mới có chứa rh IL-2 tái tổ hợp người chuẩn ACF (180 IU/mL; tương đương 10 ng/mL) để đưa mẻ nuôi cấy đạt thể tích làm việc tối đa (100 mL đối với Đĩa nuôi cấy G-Rex® 6M hoặc 500 mL đối với Hệ thống mở G-Rex® 50M; xem Bảng 1). Không cần bổ sung thêm dinh dưỡng hay thực hiện bất kỳ thao tác can thiệp nào khác trước khi thu nhận (Hình 1).

Vào ngày 7 hoặc ngày 10, thu nhận tế bào để thực hiện các đánh giá chuyên sâu tiếp theo như đếm số lượng, kiểm tra độ sống và nhuộm xác định kiểu hình (Hình 3 và 5). Thời điểm thu nhận cụ thể: ngày 7 đối với hệ thống tăng sinh G-Rex® 50M và ngày 10 đối với đĩa giếng G-Rex® 6M.

Hình 2. Khả năng sống sót và hoạt hóa tế bào T thay đổi tùy thuộc vào mật độ nuôi cấy và nồng độ chất hoạt hóa tế bào T người ImmunoCult™

Một thử nghiệm sàng lọc sơ bộ đã được thực hiện trên nhiều dải mật độ cấy và liều lượng tác nhân kích hoạt khác nhau nhằm đánh giá ảnh hưởng của chúng lên tỷ lệ sống cũng như mức độ kích hoạt của tế bào T, từ đó làm căn cứ lựa chọn các điều kiện tối ưu cho giai đoạn tăng sinh tiếp theo. Tế bào T người được phân lập từ các khối bạch cầu tươi (fresh leukopak; Mã danh mục #70500) của người hiến khỏe mạnh bằng Bộ phân lập tế bào T người EasySep™ (Mã danh mục #17951) và được bảo quản đông lạnh trong CryoStor® CS10 (Mã danh mục #07930). Vào ngày 0, tế bào T đông lạnh sau phân lập được rã đông và cấy ở các mật độ khác nhau vào Đĩa nuôi cấy G-Rex® 24 giếng, sử dụng tổng thể tích 1 mL môi trường ImmunoCult™-XF (Mã danh mục #100-0956) có bổ sung 180 IU/mL IL-2 người tái tổ hợp (rh IL-2; Mã danh mục #78145). Tế bào T được kích hoạt bằng cách kích thích với chất bổ trợ kích hoạt tế bào T người ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2 (Mã danh mục #100-0785) ở nhiều mức liều khác nhau. Vào ngày 3, tế bào thu nhận được mang đi phân tích. Tỷ lệ sống của tế bào được xác định bằng máy đếm tế bào tự động NucleoCounter® NC-250™, và phương pháp đo dòng tế bào (flow cytometry) được sử dụng để phân tích mức độ biểu hiện dấu ấn bề mặt (CD25) nhằm đánh giá trạng thái kích hoạt của tế bào T.

(A) Các cột biểu đồ biểu thị tỷ lệ sống vào ngày 3 tại từng mật độ cấy tương ứng với các nồng độ tác nhân kích hoạt khác nhau. Tỷ lệ sống giảm rõ rệt ở những tế bào được cấy ở mật độ 1,25 × 10⁵ tế bào/cm². Dữ liệu biểu diễn giá trị trung bình ± sai số chuẩn (mean ± SEM, n = 1 – 3 người hiến).

(B) Các cột biểu đồ biểu thị tần suất (tỷ lệ phần trăm) tế bào CD25+ trong quần thể CD4+ và CD8+. Việc sử dụng lượng tác nhân kích hoạt thấp hơn có thể làm tăng tần suất tế bào CD25+ sau 3 ngày kích thích (n = 1 – 3).

Hình 3. Khả năng hoạt hóa và tăng sinh tế bào T trong đĩa giếng G-Rex® 6M với thuốc thử ImmunoCult™ tạo ra mật độ tế bào sống cao.

Tế bào T người sau phân lập được kích hoạt bằng Tác nhân kích hoạt tế bào T người ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2 (Mã danh mục #100-0785) ở nồng độ 6,25 hoặc 25 µL/mL trong môi trường ImmunoCult™-XF (Mã danh mục #100-0956) có bổ sung IL-2 người tái tổ hợp (rhIL-2; Mã danh mục #78145). Tế bào được nuôi tăng sinh trong Đĩa nuôi cấy G-Rex® 6M trong 10 ngày theo quy trình ở Hình 1.

(A) Đồ thị biểu thị hệ số tăng sinh tích lũy (cumulative fold expansion) và tỷ lệ sống của tế bào; trong đó các điểm chấm biểu diễn từng điểm dữ liệu riêng lẻ và các cột hoặc đường kẻ biểu thị giá trị trung bình tương ứng (n = 2).

(B) Mật độ tế bào bề mặt được đánh giá vào Ngày 10. Việc sử dụng liều tác nhân kích hoạt giảm mang lại mật độ trung bình đạt 3,7 × 10⁷ tế bào/cm², đạt mức công suất tối đa của thiết bị (n = 2).

(C) Tần suất các dưới nhóm tế bào T CD4+ và CD8+ đã được phân tích. Đến Ngày 10, quần thể tế bào T sau tăng sinh bao gồm cả các dưới nhóm tế bào nhớ trung tâm (central memory) và nhớ hiệu ứng (effector memory).

• TN/SCM: Tế bào T nguyên vẹn và tế bào T nhớ gốc (CCR7+CD45RO−)
• TCM: Tế bào T nhớ trung tâm (CCR7+CD45RO+)
• TEM: Tế bào T nhớ hiệu ứng (CCR7−CD45RO+)
• TEFF: Tế bào T hiệu ứng (CCR7−CD45RO−)

Dữ liệu biểu diễn giá trị trung bình ± sai số chuẩn (mean ± SEM, n = 2).

(D) Đồ thị biểu thị mật độ bề mặt của các tế bào T CD8+ nhớ trung tâm (CD45RO+CCR7+). Trong tất cả các điều kiện thử nghiệm, số lượng tế bào T nhớ trung tâm đều vượt ngưỡng 2 × 10⁶ tế bào/cm², tương ứng với tổng số khoảng 2 × 10⁷ tế bào/giếng (n = 2).

Hình 4. Khả năng hoạt hóa và tăng sinh tế bào T trong hệ thống mở G-Rex® 50M với thuốc thử ImmunoCult™ tạo ra mật độ tế bào sống cao.

Tế bào T người sau phân lập được kích hoạt bằng Tác nhân kích hoạt tế bào T người ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2 (Mã danh mục #100-0785) ở nồng độ 6,25 hoặc 25 µL/mL trong môi trường ImmunoCult™-XF (Mã danh mục #100-0956) có bổ sung IL-2 người tái tổ hợp (rhIL-2; Mã danh mục #78145). Tế bào được nuôi tăng sinh trong Hệ thống G-Rex® 50M trong 7 ngày theo quy trình ở Hình 1.

(A) Đồ thị kết hợp dạng cột và điểm lần lượt biểu thị hệ số tăng sinh tích lũy trung bình và tỷ lệ sống của tế bào. Dữ liệu biểu diễn giá trị trung bình (n = 2).

(B) Mật độ tế bào bề mặt được đánh giá sau đợt tăng sinh tế bào T ngắn hạn trong 7 ngày. Năng suất đạt hơn 2 × 10⁷ tế bào/cm² (tương đương > 1 × 10⁹ tế bào/thiết bị) khi sử dụng liều tác nhân kích hoạt thấp hơn.

(C) Đồ thị biểu thị mật độ bề mặt của các tế bào T CD8+ nhớ trung tâm (CD45RO+CCR7+) vào ngày 7. Số lượng tế bào T nhớ trung tâm ở tất cả các điều kiện dao động trong khoảng 1 – 4 × 10⁶ tế bào/cm². Có ghi nhận sự biến thiên giữa các người hiến.

Hình 5. Tế bào T được tăng sinh bằng thuốc thử GMP ImmunoCult™ có khả năng tiêu diệt tế bào đích.

Tế bào T người sau phân lập được kích hoạt bằng yếu tố kích hoạt tế bào T người ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2 (Mã danh mục #100-0785) ở nồng độ 6,25 µL/mL trong môi trường ImmunoCult™-XF (Mã danh mục #100-0956) có bổ sung IL-2 người tái tổ hợp (rhIL-2; Mã danh mục #78145). Tế bào được nuôi tăng sinh trong Đĩa nuôi cấy G-Rex® 6M trong 10 ngày theo quy trình ở Hình 1. Hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxic activity) được đánh giá bằng thử nghiệm dựa trên kỹ thuật đo dòng chảy tế bào; các tế bào khối u đích NALM-6 được gắn nhãn huỳnh quang bằng CellTrace™ Violet theo hướng dẫn của nhà sản xuất và đồng nuôi cấy với các tế bào T sau tăng sinh trong Đĩa đáy tròn 96 giếng (Mã danh mục #38018) ở các tỷ lệ cảm ứng (E:T) lần lượt là 3:1, 1:1 và 0,3:1 trong môi trường ImmunoCult™-XF không bổ sung cytokine. Một hỗn hợp kháng thể đặc hiệu kép (bispecific antibody cocktail) nhắm đồng thời vào tế bào T và tế bào khối u được bổ sung để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tiêu diệt tế bào đích. Sau 4 – 5 giờ đồng nuôi cấy, tế bào được rửa bằng PBS và nhuộm với Annexin V (Mã danh mục #100-0328) cùng DRAQ7™ trước khi tiến hành phân tích. Tỷ lệ phần trăm tiêu diệt tế bào (percentage of killing) được xác định dựa trên tần suất các tế bào đích mang dấu huỳnh quang Annexin V+. Tế bào T sau tăng sinh từ 2 người hiến độc lập (A và B) đều thể hiện năng lực gây độc tế bào mạnh mẽ khi đồng nuôi cấy cùng các tế bào khối u NALM-6.

Xem thêm: Giải Pháp Nuôi Cấy, Tăng Sinh và Bảo Quản Tế Bào Cho Liệu Pháp Tiên Tiến