Phương Pháp Làm Lắng Tế Bào Hồng Cầu Từ Các Mẫu Máu Tươi

Làm giảm lượng tế bào hồng cầu là gì?

Làm giảm lượng tế bào hồng cầu (RBC) là một phần quan trọng trong việc chuẩn bị mẫu cho các xét nghiệm nuôi cấy cụm tế bào (CFU) của máu tươi. Việc loại bỏ các tế bào hồng cầu sẽ giảm nền trong các đĩa nuôi cấy (Hình 1) và đảm bảo rằng các cụm tế bào tạo máu có thể được đếm chính xác, cho dù sử dụng thủ công bằng kính hiển vi đảo ngược hay hệ tự động sử dụng STEMvision™ (Hình 2). Các tế bào hồng cầu phải được làm cạn kiệt từ mẫu máu tươi chưa qua xử lý (mẫu máu cuống rốn hoặc máu ngoại vi), lớp “bufft coat”, các tế bào đơn nhân và máu được được phân tách bằng cách ly tâm tỷ trọng (ví dụ: Lymphoprep™) hoặc được xử lý bằng thiết bị tách tế bào tự động (ví dụ: hệ thống AXP cho máu cuống rốn)

STEMCELL Technologies Inc. đã phát triển một quy trình đơn giản sử dụng HetaSep™ để loại bỏ các tế bào hồng cầu từ các mẫu máu tươi để chuẩn bị cho việc nuôi cấy CFU. HetaSep™ là một chất kết tụ hồng cầu được sử dụng để nhanh chóng tách các tế bào có nhân ra khỏi các tế bào hồng cầu. Hiệu quả của nó dựa trên nguyên tắc rằng các tế bào hồng cầu kết tụ vào nhau và lắng xuống nhanh hơn nhiều so với các tế bào khác. Quy trình HetaSep™ chỉ cần 50 μL máu, mất khoảng 15 - 20 phút và chỉ yêu cầu đếm tế bào khi bắt đầu quy trình (lúc tế bào được cấy trong đĩa CFU). Khả năng phục hồi của các cụm tế bào trong phần mẫu máu được xử lý HetaSep™ để làm suy giảm hồng cầu là gần 100% nên người dùng có thể tin tưởng rằng quy trình HetaSep™ không ảnh hưởng xấu đến số lượng hoặc khả năng tồn tại của các tế bào tiền thân tạo máu (Hình 3). Các tính năng này giúp dễ dàng kết hợp HetaSep™ vào quy trình nuôi cấy CFU của các tổ chức.

Hình 1. Hình ảnh STEMvision™ của các thử nghiệm CFU được loại bỏ hồng cầu trước bằng HetaSep™. (A) Số lượng tế bào hồng cầu tối thiểu cho nuôi cấy CFU với xử lý HetaSep™ trước đó và (B) Số lượng tế bào hồng cầu không thể chấp nhận cho nuôi cấy CFU mà không xử lý HetaSep™ trước đó. Lưu ý rằng có thể nhìn thấy ít cụm tế bào hơn do nền hồng cầu tăng lên.

Hình 2. Cần loại bỏ hồng cầu để đếm chính xác các xét nghiệm nuối cấy CFU với STEMvision™

Được hiển thị đây là số lượng cụm tế bào có trong xét nghiệm nuôi cấy CFU máu cuống rốn (A) không có và (B) có làm giảm hồng cầu bằng cách sử dụng HetaSep™ trước khi cấy (n = 10 mẫu máu cuống rốn tươi). Sự khác biệt lớn trong (A) là do tỷ lệ cao các cụm tế bào dương tính giả được STEMvision™ đếm được trong các mẫu có nền hồng cầu cao.

Khả năng phục hồi của CFU trong phần được xử lý giảm hồng cầu là gần 100% nên người dùng có thể tin tưởng rằng quy trình HetaSep^TM không ảnh hưởng xấu đến số lượng hoặc khả năng sống sót của các tế bào tiền thân tạo máu (Hình 3).

Hình 3. Trung bình 97% số cụm tế bào được phục hồi sau khi làm giảm lượng tế bào hồng cầu với HetaSep™

Mẫu máu cuống rốn (n = 10) được chia thành hai phần, một trong số đó được cấy trong xét nghiệm nuôi cấy CFU mà không làm suy giảm hồng cầu và phần còn lại có lượng hồng cầu bị cạn kiệt bằng cách sử dụng quy trình HetaSep™ trước khi cấy. Mỗi loại mẫu được cấy thành hai bản. Các xét nghiệm nuôi cấy CFU được tính theo cách thủ công và tỷ lệ phần trăm số cụm tế bào thu hồi trong mỗi phần bị suy giảm hồng cầu được tính toán so với kết quả xét nghiệm nuôi cấy CFU của các tế bào không bị cạn kiệt từ cùng một mẫu.

Quy trình HetaSep™ cho các mẫu máu tươi thể tích ít.

1. Xác định nồng độ tế bào của máu tươi ban đầu
2. Thêm các chất sau vào ống 0,5 mL: 150 μL Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) với 2% fetal bovine serum (FBS) (Danh mục # 07905). 50 μL mẫu máu tươi. 40 μL HetaSep™
3. Hệ số pha loãng mẫu là 4.8 (tổng thể tích 240 μL ÷ 50 μL thể tích mẫu).
4. Trộn kỹ bằng pipet. Tránh tạo bong bóng. Không trộn xoáy.
5. Ủ 15 - 20 phút trong tủ ấm 37°C. Tốt nhất nên thực hiện bước này bằng cách đặt các ống vào tủ ấm nuôi cấy thay vì đặt trong nồi cách thủy, vì bước này dẫn đến nguy cơ nhiễm bẩn bởi nước dư khi mở ống. Lưu ý: Độ phục hồi tế bào có thể giảm nếu ủ mẫu hơn 20 phút. Nếu đã hơn 20 phút, quay lại bước 3 hoặc bắt đầu lại quy trình với mẫu mới để đảm bảo phục hồi tối ưu.
6. Loại bỏ phần dịch nổi ở trên bằng micropipette và chuyển sang ống mới. Hút từ từ phần trên, đồng thời di chuyển đầu hút xuống dưới. Không làm xáo trộn hồng cầu (Hình 4B). Lưu ý: Kích thước của các tế bào hồng cầu kết tụ có thể khác nhau do sự khác biệt về hematocrit giữa các loại mẫu. Nếu phần hồng cầu kết tụ bị xáo trộn bất kỳ lúc nào, hãy quay lại bước 3.
7. Tính nồng độ tế bào của mẫu đã loại bỏ hồng cầu bằng cách hiệu chỉnh hệ số pha loãng là 4,8 (xem bước 2). Ví dụ, nếu nồng độ tế bào ban đầu là 5 x 10⁶ tế bào/mL, thì nồng độ của mẫu đã loại bỏ hồng cầu sẽ là 5 x 10⁶ tế bào/mL ÷ 4,8 = 1,04 x 10⁶ tế bào/mL.
8. Thiết lập nuôi cấy CFU.

Hình 4. Hình thức mẫu trước và sau khi ủ. Ống 1,5 mL chứa máu cuống rốn (A) ngay sau khi thêm HetaSep™ và (B) sau khi ủ 20 phút khi các tế bào hồng cầu đã kết tụ ở đáy ống.