Phân Lập và Lưu Trữ Tế Bào Gốc Tạo Máu Từ Máu Ngoại Vi Để Ghép Tự Thân

Phân Lập và Lưu Trữ Tế Bào Gốc Tạo Máu Từ Máu Ngoại Vi Để Ghép Tự Thân

Phân Lập và Lưu Trữ Tế Bào Gốc Tạo Máu Từ Máu Ngoại Vi Để Ghép Tự Thân

Download file

Ghép tủy xương là một liệu pháp hiệu quả cho một số bệnh rối loạn tủy ác tính và không ác tính và được cho là mang lại cơ hội sống sót lâu dài tốt nhất cho bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu (leukemia) hoặc u nguyên bào thần kinh tiến triển (advanced neuroblastoma) mà các phương pháp điều trị khác đã thất bại. Tuy nhiên, thật không may, chỉ một phần ba trong số những bệnh nhân này có sẵn người hiến tủy tương thích và có rất ít lựa chọn điều trị cho những người không có, mặc dù hiện nay người ta đang cố gắng mở rộng nhóm người hiến tủy bằng cách thêm tủy của người hiến phù hợp một phần.

Do đó, gần đây đã có nhiều mối quan tâm đến việc sử dụng tế bào gốc máu ngoại vi tự thân (TBG MNV) để ghép và các nguyên tắc cơ bản của quy trình này đã được xem xét rộng rãi. Ưu điểm của việc sử dụng PBSC tự thân thay vì tủy xương là chúng có thể được lấy mà không cần sử dụng thuốc mê và không gây khó chịu khi hút nhiều tủy xương. Phương pháp này không bị giới hạn bởi độ tuổi của bệnh nhân và nó có khả năng áp dụng cho tất cả bệnh nhân mắc các rối loạn ác tính. Hơn nữa, khả năng lây nhiễm PBSC với các tế bào khối u là thấp. Hơn nữa, TBG MNV khôi phục các chức năng tạo máu và miễn dịch nhanh hơn so với các tế bào gốc tủy, như thể hiện trong các thí nghiệm sử dụng số lượng tế bào gốc (CFU-GM) bằng nhau. Do đó, việc thu thập và bảo quản lạnh TBG MNV tự thân và sau đó ghép chúng sau khi hóa trị liều cao (high-dose cytoreduction) dường như là một quy trình hữu ích để chữa khỏi bệnh nhân mắc các rối loạn ác tính khó điều trị bằng các phương pháp điều trị khác và không có sẵn tủy xương để ghép.

Kỹ thuật xử lý tế bào gốc máu ngoại vi (TBG MNV):

1) Nhận túi thu thập MNV từ phòng thu nhận (MNV sau khi được thu thập từ người cho bằng máy chiết tách tế bào tự động). Mẫu được vận chuyển và được bảo quản đến khi xử lý ở nhiệt độ 4-15oC. Thời gian xử lý tối đa không quá 48 giờ sau thu thập.

2) Định lượng toàn bộ túi MNV thu được bằng cách cân khối lượng (đơn vị gram), ghi lại kết quả để lấy cơ sở tách huyết tương ở bước 4. Tỷ lệ quy đổi thể tích V (mL) từ khối lượng m (gram) với khối lượng riêng ρ (thường được tính 1.057):

V = m/ρ

Ví dụ: Cân túi thu thập được 100gr, sau quy đổi: V = 100/1.057 = 94.61 mL

3) Kết nối túi thu thập và túi chuyển bằng máy nối dây vô trùng, sau đó đặt các túi vào bucket 1,000mL của máy ly tâm lạnh, đặt đối xứng và cân bằng trọng lượng (nếu xử lý 1 mẫu/lần, phải đặt vật cùng khối lượng vào bucket đối trọng) và cài đặt chương trình ly tâm ở tốc độ 1,400rpm trong 10 phút, nhiệt độ ly tâm là 10oC (chương trình ly tâm này có thể được diều chỉnh tùy vào điều kiện thực tế của phòng xử lý MNV).

(Mục đích của bước này nhằm giảm thể tích lưu trữ tế bào gốc máu ngoại vi là tách bỏ bớt lớp huyết tương (plasma) nhằm tiết kiệm không gian bảo quản đông lạnh).

4) Chuyển huyết tương sang túi chuyển 500mL (transfer bag) bằng bàn ép huyết tương, phần dung dịch tế bào còn lại sẽ được lấy mẫu test lần 1 để kiểm tra các chỉ tiêu theo quy định. Thực hiện bằng cách kết nối dụng cụ lấy mẫu vào cổng của túi thu thập và rút mẫu vào các ống vials 1,5mL (quá trình thao tác được thực hiện trong phòng sạch với mức độ an toàn sinh học cấp 2). Sau đó, mẫu test được đem đi kiểm tra:

a. Đếm số lượng tế bào MNCs (đơn vị: tế bào/mL):

  • Rút 20µL dung dịch tế bào gốc.
  • Pha loãng với 380µL dung dịch Natriclorua 0.9% (được dung dịch pha loãng 1/20, tỷ lệ dung dịch TBG: dung dịch Natriclorua 0.9% = 1:19).
  • Đo với máy đếm tổng phân tích tế bào tự động hoàn toàn.
  • Đo 3 lần để lấy giá trị trung bình.

b. Đếm số lượng tế bào CD34+:

  • Rút 30µL dung dịch tế bào gốc.
  • Đếm số lượng tế bào bằng máy đếm tế bào CD34+ hoặc máy Flow cytometry.
  • Đo 3 lần để lấy giá trị trung bình.

c. Nuôi cấy cụm tế bào (CFU assay): thực nuôi cấy trên môi trường “Gold Standard” MethoCult (tham khảo quy trình chi tiết trong tài liệu cung cấp kèm).

  • Chuẩn bị môi trường nuôi cấy.
  • Chuẩn bị dung dịch pha loãng TBG MNV.
  • Chuẩn bị đĩa nuôi cấy.
  • Trộn môi trường nuôi cấy và dịch pha loãng tế bào gốc máu ngoại vi theo tỷ lệ khuyến nghị cho từng thí nghiệm muốn bố trí.
  • Phân phối vào đĩa nuôi cấy vô trùng 35mm và lồng vào đĩa 100mm theo hướng dẫn.
  • Ủ ở 37°C, 5% CO2, ≥ 95% ẩm trong 7 ngày đối với môi trường MethoCult™ Express và 14 - 16 ngày đối với môi trường nuôi cấy MethoCult™ khác.
  • Đếm kết quả sau 7 ngày, 14 ngày bằng kính hiển vi soi ngược hoặc hệ thống đếm CFU tự động.
  • Trường hợp không đếm được vào ngày quy định, tham khảo thêm cách xử lý trong tài liệu cung cấp kèm.

d. Cấy vi sinh (bằng hệ thống nuôi cấy vi khuẩn tự động).

e. Huyết đồ (bằng máy phân tích huyết học).

5) Nếu thể tích dung dich TBG MNV thu được nhiều hơn 100 mL, nên chia ra và bảo quản đông sâu ở các túi bảo quản đông lạnh CryoStore.

6) Chuẩn bị 40mL dung dịch nước muối 0,9% (Normal Saline) trong một falcon vô trùng. Sau đó, thêm vào 50mL dung dịch HSA 20%. Sau cùng, bơm 10 mL dung dịch DMSO (hàm lượng > 99%, Protide Pharmaceutical, Mỹ). Thể tích cuối thu được là 100mL, có nồng độ 5% DMSO và 5% HAS.

Cho dung dịch bảo quản đông lạnh vừa chuẩn bị ở trên vào 100mL mẫu tế TBG MNV (đã bao gồm chất chống đông), nghĩa là tỷ lệ 1:1.

7) Chuyển dung dịch tế bào gốc sang túi bảo quản đông lạnh CryoStore bằng cách dùng xi lanh (thể tích 60mL, có đầu luer lock).

8) Lấy mẫu test lần 2 để kiểm tra các chỉ tiêu theo quy định giống bước 4.

(Đảm bảo số lượng tế bào MNCs trong túi bảo quản phải < 1x1010 tế bào/túi)

9) Bơm dung dich bảo quản lạnh (đã chuẩn bị ở bước 6) vào túi bảo quản đông lạnh CryoStore (qua cổng female).

10) Tạo các mối hàn (khuyến nghị máy hàn được vật liệu nhựa EVO và EVA) và cắt bỏ các đoạn dây túi đã sử dụng để làm gọn phần túi bảo quản đông lạnh.

11) Dán nhãn và ghi thông tin túi bảo quản TBG (có thể cân nhắc sử dụng quản lý mẫu bằng mã vạch barcode đáp ứng tiêu chuẩn ISBT 128).

12) Sử dụng máy hàn túi overwrap có chức năng hàn và đẩy khí để hàn kín túi bao ngoài, nhằm bảo vệ an toàn đơn vị tế bào gốc máu ngoại vi.

Kỹ thuật lưu trữ tế bào gốc máu ngoại vi:

  1. Đặt túi đông lạnh tế bào đã được hàn kín trong túi overwrap vào hộp cassette phù hợp và dán nhãn (nhãn mã vạch). Tạo nên các đơn vị TBG MNV tiêu chuẩn.
  2. Đặt cassette (chứa đơn vị tế bào gốc máu ngoại vi) vào thiết bị hạ nhiệt độ theo chương trình (CRF) với chương trình hạ nhiệt độ đã được lập trình.

Khi quá trình hạ nhiệt mẫu kết thúc, nhiệt độ túi bảo quản tế bào gốc khoảng -90 đến -160oC.

  1. Sau khi hạ nhiệt độ mẫu, nhanh chóng chuyển cassette vào giá đỡ canister và đặt vào frame. Sau đó, tiến hành lưu trữ trong bình lưu trữ mẫu (ở nhiệt độ -196oC) càng nhanh càng tốt (để tránh hiện tượng gia nhiệt tạm thời của mẫu - TWEs). Quá trình lưu trữ được thực hiện, bảo quản cho đến khi có chỉ định sử dụng đơn vị TBG MNV.

(Ghi chú: ghi nhận thông tin mẫu, ngày lưu, vị trí lưu mẫu trong thiết bị lưu trữ đông lạnh để thuận tiện cho quá trình lấy mẫu ghép).               

Nguồn cấp nitơ lỏng phải được cung cấp đầy đủ, liên tục và ổn định trong suốt quá trình lưu trữ, nhằm đảm bảo chất lượng các đơn vị TBG MNV chứa trong bình lưu trữ mẫu).

  1. Thời gian lưu trữ có thể lên đến 18 năm. Tuy nhiên, hiện tại giới hạn về thời gian bảo quản mẫu tế bào gốc máu ngoại vi vẫn chưa được xác định chính thức.

Kỹ thuật giải đông (rã đông) mẫu tế bào gốc máu ngoại vi trước khi ghép:

  1. Lấy canister chứa túi tế bào gốc máu ngoại vi ra khỏi hệ thống bảo quản tế bào gốc (tank nitơ lỏng lưu trữ tế bào gốc).
  2. Kiểm tra đúng thông tin mẫu, bệnh nhân.
  3. Túi tế bào gốc được rã đông trong bình điều nhiệt nước 37oC (sử dụng bể water bath) có khuấy đối lưu hoặc máy rã đông tự động (có lập trình).
  4. Lấy mẫu test lần 3 để kiểm tra tỷ lệ sống/chết, khả năng biệt hóa tế bào sau quá trình bảo quản trong nitơ lỏng trước khi bàn giao túi TBG cho phòng ghép.
  5. Nếu cần, thực hiện rửa loại bỏ dung dịch chất bảo quản đông lạnh (dung dịch DMSO) trước khi ghép (có thể áp dụng ở một số phòng Lab).

Ghi chú: t​​​​​​ài liệu kỹ thuật này mang tính chất tham khảo, cần phải thẩm định hiệu quả quy trình thực hiện tại cơ sở của người dùng, vì có sự khác biệt về phương pháp, thể tích xử lý máu ngoại vi, thiết bị, v.v. Để được hổ trợ, hãy liên hệ với chúng tôi.

Tài liệu tham khảo:

  • Veeraputhiran, Muthu; Theus, John W.; Pesek, Gina; Barlogie, Bart; Cottler-Fox, Michele (2010). Viability and engraftment of hematopoietic progenitor cells after long-term cryopreservation: effect of diagnosis and percentage dimethyl sulfoxide concentration. Cytotherapy, 12(6), 764–766. doi:10.3109/14653241003745896. Original scientific paper.
  • Y Takaue, T Watanabe, Y Kawano, T Koyama, T Abe, T Suzue, J Satoh, T Shimokawa, T Ninomiya and M Kosaka. Isolation and storage of peripheral blood hematopoietic stem cells for autotransplantation into children with cancer. bloodjournal.hematologylibrary.org. 1989 74: 1245-1251.

Search

Categories

Lưu trữ

Những chủ đề khác