Điều gì ảnh hưởng đến sự đồng nhất giữa các lần nuôi cấy tế bào?

Bạn có từng gặp tình huống một dòng MSC phát triển rất tốt ở lần nuôi cấy đầu tiên, nhưng chỉ vài tuần sau, dù sử dụng đúng protocol, cùng môi trường và cùng người thao tác, kết quả lại hoàn toàn khác? Đây là vấn đề mà hầu như phòng thí nghiệm nào cũng từng gặp.

Hiện tượng thiếu ổn định này không chỉ làm tiêu tốn thời gian và lãng phí ngân sách nghiên cứu mà còn là tác nhân chính dẫn đến “cuộc khủng hoảng độ lặp lại – reproducibility crisis ” trong khoa học sự sống, gây trở ngại lớn cho quá trình ứng dụng lâm sàng và sản xuất sinh dược phẩm. Thực chất, câu trả lời cho sự sai khác này nằm ở những biến số cực kỳ nhỏ nhưng mang tính quyết định đến từ chất lượng của vi môi trường nuôi cấy, sự biến thiên giữa các lô sản xuất và các chi tiết thao tác kỹ thuật thường bị bỏ qua.

Protocol giống nhau không có nghĩa là điều kiện giống nhau

Một protocol chỉ quy định các bước thực hiện như loại môi trường, mật độ gieo cấy hay thời gian thay môi trường. Tuy nhiên, tế bào là hệ thống sống rất nhạy cảm với những thay đổi nhỏ của môi trường.

Khác với các phản ứng hóa học thuần túy, tế bào sống liên tục phản hồi và tự điều chỉnh trạng thái sinh lý trước những thay đổi dù là nhỏ nhất của môi trường xung quanh. Chỉ cần nhiệt độ dao động nhẹ, pH thay đổi hoặc nồng độ CO₂ không ổn định, quá trình trao đổi chất của tế bào đã có thể bị ảnh hưởng. Theo hướng dẫn của ATCC, việc kiểm soát ổn định các điều kiện nuôi cấy và thường xuyên kiểm tra chất lượng môi trường là yếu tố quan trọng để đảm bảo kết quả nghiên cứu có thể lặp lại.

Chất lượng môi trường nuôi cấy – Yếu tố quyết định tính tái lập

Môi trường cơ bản và FBS thành phần gây biến động lớn nhất

Môi trường nuôi cấy cơ bản đóng vai trò cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết để tế bào phát triển và duy trì chức năng bình thường. Nếu thành phần dinh dưỡng không phù hợp, độ pH mất ổn định hoặc xuất hiện tạp chất trong quá trình sản xuất, bảo quản hoặc sử dụng, tế bào có thể bị stress, giảm khả năng tăng trưởng và dẫn đến kết quả nuôi cấy không nhất quán.

Huyết thanh bò thai (FBS) từ lâu đã được bổ sung vào môi trường cơ bản với tỷ lệ từ 5% đến 20% để cung cấp các yếu tố tăng trưởng, hormone và protein bám dính cần thiết cho hầu hết các dòng tế bào động vật có vú. FBS chứa hàng ngàn phân tử sinh học với nồng độ biến động tùy thuộc vào xuất xứ địa lý của đàn bò, điều kiện khí hậu, dịch bệnh, chế độ ăn của bò mẹ và quy trình thu hoạch máu tại các cơ sở giết mổ. Sự thiếu tiêu chuẩn hóa này khiến mỗi lô FBS trở thành một thành phần sinh học không thể kiểm soát từ đó là nguyên nhân dẫn đến tình trạng không đồng nhất giữa các lô (Lot-to-Lot Variation).

Lot-to-Lot Variation – nguyên nhân thường bị bỏ qua

Lot-to-Lot Variation hay còn gọi là batch-to-batch variability là hiện tượng các lô (lot) sản xuất khác nhau của cùng một sản phẩm vẫn có sự khác biệt nhất định về thành phần hoặc hiệu suất, dù được sản xuất theo cùng quy trình. Điều này đặc biệt phổ biến đối với các sản phẩm sinh học như: Fetal Bovine Serum (FBS); Human Platelet Lysate (HPL); Cytokine; Growth Factor; Extracellular Matrix; Một số môi trường nuôi cấy bổ sung protein.

Trong một quy trình nuôi cấy lý tưởng, mỗi lô sản phẩm được xuất xưởng phải hoàn toàn đồng nhất để không làm thay đổi tính chất sinh lý của tế bào hay kết quả sau nuôi cấy. Tuy nhiên, do tính chất phức tạp của các thành phần serum, protein, hormone, lipid hay các yếu tố tăng trưởng và các điều kiện chế biến và bảo quản, sự biến động này vẫn xảy ra một cách không mong muốn.

Lot-to-Lot Variation ảnh hưởng như thế nào?

Mặc dù sự khác biệt giữa các lô thường không lớn, nhưng đối với tế bào, những thay đổi nhỏ này vẫn đủ tạo ra khác biệt đáng kể. Các chất bổ sung có nguồn gốc tự nhiên có sự biến động rất lớn về nồng độ các hormone, protein bám dính và yếu tố tăng trưởng giữa các mẻ thu hoạch. Điều này trực tiếp làm biến đổi tốc độ nhân đôi, khả năng bám dính, hình thái tế bào thay đổi và ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các marker cũng như khả năng biệt hoá của tế bào…

Gây thất bại cho việc mở rộng quy mô (scaling up) và sản xuất công nghiệp: Trong nghiên cứu và phát triển sinh dược phẩm đặc biệt là liệu pháp tế bào, sự biến động của các lô sản phẩm nguyên liệu nuôi cấy có thể làm thay đổi hiệu suất tăng sinh và làm thay đổi các thuộc tính chất lượng quan trọng của sản phẩm (CQAs – Critical Quality Attributes) ở sản phẩm cuối cùng. Sự sai lệch này có thể khiến cả một lô sản xuất lớn bị loại bỏ, gây thiệt hại nghiêm trọng về thời gian và kinh tế.

Bảo quản và sử dụng hóa chất đúng cách

Việc lựa chọn môi trường phù hợp với từng loại tế bào, bảo quản đúng điều kiện và sử dụng theo khuyến cáo của nhà sản xuất là những yếu tố quan trọng để duy trì tính ổn định của quá trình nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy bắt buộc phải được bảo quản đông lạnh ở nhiệt độ dưới -20oC để giữ được sự ổn định của các thành phần và hoạt tính. Khi sử dụng, quy trình chuẩn đòi hỏi phải rã đông chậm qua đêm trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 2 – 8°C.

Tuy nhiên một sai sót rất phổ biến là đặt trực tiếp chai huyết thanh đông đá vào bể điều nhiệt ở 37°C hoặc rã đông nhanh ở nhiệt độ phòng. Sự thay đổi nhiệt độ đột ngột này làm biến tính các protein hòa tan, kích hoạt hiện tượng kết tủa protein và sợi fibrin, làm suy giảm nghiêm trọng hoạt tính sinh học của môi trường. Ngoài ra, việc lặp lại chu kỳ đông – rã đông nhiều lần cũng làm hủy hoại chất lượng sản phẩm; do đó, việc rã đông một lần rồi chia nhỏ (aliquot) thành các phần là bước bắt buộc để duy trì tính đồng nhất.

Những biến số ngoài protocol ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy

Điều kiện môi trường nuôi cấy

Các điều kiện vật lý trong phòng thí nghiệm cũng quyết định sự ổn định của môi trường nuôi cấy. Tủ nuôi cấy tế bào hiện đại không chỉ cần duy trì ổn định nhiệt độ (37°C), CO₂ (thường 5%) và độ ẩm (>90%) mà nhiều hệ thống còn cho phép kiểm soát nồng độ O₂ (Tri-gas Incubator). Việc kiểm soát đồng thời CO₂ và O₂ giúp mô phỏng gần hơn môi trường sinh lý của tế bào, đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu tế bào gốc, miễn dịch, ung thư và nuôi cấy 3D.

• Kiểm soát CO₂ và pH: Dao động CO₂ chỉ 1–2% cũng có thể phá hỏng cả dòng tế bào, vì làm lệch pH đệm bicarbonate trong môi trường. Phenol đỏ được thêm vào hầu hết các công thức môi trường nuôi cấy tế bào như một chất chỉ thị pH trực quan vô cùng nhạy bén. Khi tế bào sinh trưởng bình thường, chúng tiêu thụ chất dinh dưỡng và thải ra các sản phẩm phụ có tính axit (như axit lactic), làm độ $pH$ của môi trường giảm xuống, chuyển màu của phenol đỏ từ đỏ tươi sang màu cam nhạt hoặc vàng. Đây là tín hiệu sinh học tự nhiên báo hiệu tế bào cần được thay môi trường hoặc cấy chuyền sang đĩa nuôi cấy mới.

• Điều kiện nồng độ O2: Khi nhắc đến tủ nuôi cấy tế bào, đa số mọi người thường nghĩ đến 37°C và 5% CO₂. Tuy nhiên, một yếu tố ngày càng được quan tâm trong các phòng thí nghiệm hiện đại là nồng độ oxy (O₂). Đối với các dòng tế bào như Mesenchymal Stem Cells (MSCs), nhiều nghiên cứu cho thấy việc nuôi cấy ở điều kiện oxy sinh lý (khoảng 2–5% O₂) có thể giúp duy trì đặc tính tế bào gốc tốt hơn, giảm stress oxy hóa và cải thiện khả năng tăng sinh so với điều kiện oxy khí quyển truyền thống. Tuy nhiên, không phải mọi dòng tế bào đều cần nuôi ở nồng độ O₂ thấp. Nếu nồng độ O₂ không được kiểm soát ổn định giữa các lần nuôi cấy, tế bào có thể thay đổi tốc độ tăng sinh và biểu hiện gen, dẫn đến kết quả khác nhau dù protocol không thay đổi.

• Nhiệt độ và độ ẩm: Tủ ấm cần giữ nhiệt độ 37°C liên tục, không dao động quá ±0,1°C, cùng độ ẩm ~95% để tránh môi trường bị khô và tế bào bị stress. Mọi dao động nhỏ về nhiệt độ (ví dụ ±1°C) hoặc CO₂ đều có thể kích hoạt cơ chế sốc nhiệt, thay đổi quá trình trao đổi chất và hành vi của tế bào.

Bảng 1: Điều kiện nuôi cấy tế bào

Yếu tố tế bào và thao tác cấy

Bản thân đặc tính của tế bào và cách thao tác cũng ảnh hưởng lớn. Cụ thể:
• Passage của tế bào: Qua nhiều lần cấy chuyền, tế bào có thể thay đổi biểu hiện gen, giảm khả năng tăng sinh hoặc xuất hiện hiện tượng lão hóa. Vì vậy, nhiều phòng thí nghiệm quy định số passage tối đa cho từng dòng tế bào để đảm bảo dữ liệu luôn nhất quán.

• Mật độ gieo cấy: Số lượng tế bào gieo ban đầu quá thấp hoặc quá cao so với yêu cầu của dòng tế bào sẽ làm giảm khả năng bám dính và tương tác tế bào. Việc này cần được chuẩn hóa cho từng loại tế bào.

• Kỹ thuật xử lý: Dùng trypsin hoặc pipet quá mạnh sẽ tổn thương màng tế bào, phá hủy protein kết dính. Kết quả là tế bào khó bám hoặc chết sau khi gieo, làm thay đổi mật độ và chức năng của dòng tế bào. Cách pha loãng môi trường, tốc độ thay môi trường, tất cả các bước thao tác đều cần đồng nhất để tránh sai khác.

Thao tác và kiểm soát nhiễm

Một trong những nguyên nhân lớn khiến kết quả nuôi cấy dao động là nhiễm khuẩn, nấm hoặc Mycoplasma trong môi trường nuôi. Vi khuẩn, nấm đều gây đục môi trường, thay đổi pH nhanh và có thể nhìn thấy các cấu trúc lạ dưới kính hiển vi. Mycoplasma thì khó phát hiện vì không làm đục môi trường nhưng âm thầm làm giảm đáng kể tốc độ sinh trưởng và thay đổi đặc tính tế bào, khiến kết quả thí nghiệm không ổn định.

Quá trình thao tác, sử dụng pipet, hóa chất, dụng cụ cấy đã bị nhiễm đều tạo điều kiện cho vi sinh xâm nhập. Nước ủ trong tủ ấm nếu không thay thường xuyên hoặc không thêm chất khử khuẩn sẽ trở thành môi trường phát triển nấm mốc. Tủ cấy không được vệ sinh kỹ càng cũng cho phép bào tử vi sinh tích tụ.

Xem thêm: Các chất gây ô nhiễm phổ biến trong phòng sạch và cách phòng ngừa

Kiểm soát chất lượng tế bào gốc trong ứng dụng lâm sàng

Những biến số kể trên không chỉ ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy mà còn tác động trực tiếp đến chất lượng của sản phẩm tế bào. Vì vậy, trong sản xuất tế bào gốc theo cGMP, các nhà sản xuất phải xây dựng hệ thống Quality Control dựa trên CQAs và CPPs

Theo các hướng dẫn của FDA, EMA và nhiều cơ quan quản lý trên thế giới, quy trình sản xuất cần tuân thủ cGMP, xây dựng quy trình thao tác chuẩn (SOP), xác định Critical Quality Attributes (CQAs) và Critical Process Parameters (CPPs), đồng thời thiết lập hệ thống kiểm soát chất lượng toàn diện. CQAs là những đặc tính quyết định chất lượng của sản phẩm, như khả năng tăng sinh, biệt hóa, độ tinh khiết, tỷ lệ sống và hoạt tính của tế bào. Trong khi đó, CPPs là các thông số của quá trình sản xuất có ảnh hưởng trực tiếp đến các CQAs, bao gồm thành phần môi trường nuôi cấy, mật độ tế bào, thời gian nuôi, nhiệt độ, CO₂, O₂ và chất lượng nguyên liệu. Nếu một CPP thay đổi, chất lượng tế bào cũng có thể thay đổi dù vẫn sử dụng cùng một protocol.

Nội dung kiểm soát chất lượng không chỉ bao gồm việc theo dõi các CQAs và CPPs mà còn đánh giá vô khuẩn, Mycoplasma, nội độc tố (Endotoxin), độ ổn định di truyền, khả năng tăng sinh, biệt hóa và hoạt tính của tế bào. Ví dụ đối với tế bào gốc trung mô (MSCs), các tiêu chí quan trọng còn bao gồm biểu hiện các marker CD73, CD90 và CD105, khả năng biệt hóa thành tế bào xương, sụn và mỡ, cũng như các thử nghiệm về độ tinh khiết và an toàn. Việc ghi nhận đầy đủ hồ sơ chất lượng trong suốt quá trình sản xuất cũng là yêu cầu quan trọng nhằm đảm bảo tính nhất quán và hỗ trợ cải tiến liên tục hệ thống kiểm soát chất lượng

Làm thế nào để tăng tính tái lập của kết quả nuôi cấy?

Để giảm thiểu sai khác, phòng thí nghiệm cần chuẩn hóa nghiêm ngặt mọi khâu và lựa chọn môi trường và hoá chất cũng như thiết bị sao cho đồng nhất và phù hợp.

• Sử dụng đúng loại môi trường và bổ sung (theo khuyến cáo của ATCC), kiểm tra hạn sử dụng và chất lượng FBS. Định kỳ đo pH và thay môi trường kịp thời.

• Chuyển đổi sang môi trường không huyết thanh và xác định hóa học (Chemically Defined/Serum-Free Media): Đây được coi là tiêu chuẩn vàng mới trong nuôi cấy tế bào hiện đại. Do mọi thành phần hóa học và nồng độ của chúng đều được xác định rõ ràng, loại môi trường này giúp loại bỏ hoàn toàn sự biến động giữa các lô sản xuất của FBS, đồng thời ngăn chặn tuyệt đối nguy cơ lây nhiễm các tác nhân ngoại lai từ động vật.

Tìm hiểu thêm: Môi Trường CellCor™ CD MSC AOF – GMP

• Thiết bị: Hiệu chuẩn định kỳ tủ ấm CO₂ (đảm bảo CO₂, nhiệt độ đúng mức) và thay nước, bộ lọc HEPA theo hướng dẫn. Hiện nay việc lựa chọn tủ ấm gia nhiệt tự động hoặc gia nhiệt bào áo nước cũng đang được nhiều đơn vị xem xét và lựa chọn. Hiện nay điều kiện O2 cũng là một yếu tố cho thấy được hiệu quả trong kết quả nuôi cấy. Lựa chọn thiết bị có tính ổn định cao, giảm dao động vì “thiết bị tốt sẽ làm tăng tính tái lập của kết quả”

Xem thêm: Sự khác biệt giữa tủ ấm CO₂ gia nhiệt áo nước và tủ ấm CO₂ gia nhiệt trực tiếp

Tìm hiểu thêm: Tủ ấm CO₂ NuAire In-VitroCell® NU-5731 (Có Kiểm Soát O₂

• Kiểm soát nhiễm tạp: Tuân thủ nghiêm quy trình vô trùng, thường xuyên vệ sinh tủ cấy và môi trường làm việc. Xét nghiệm định kỳ Mycoplasma và thay nước tủ ấm để ngăn ngừa vi sinh phát triển.

• Điều kiện thao tác: Đào tạo nhân viên cẩn thận, quy định mật độ gieo cấy và số passage tối đa cho mỗi dòng. Hạn chế mở nắp hộp cấy, thao tác nhanh gọn. Việc sắp xếp quá nhiều vật dụng bên trong tủ an toàn sinh học (biosafety cabinet) sẽ làm gián đoạn dòng khí laminar flow, dẫn đến nguy cơ hút các bào tử nấm hoặc vi khuẩn từ môi trường ngoài vào đĩa nuôi cấy.

Những biện pháp này tuy đơn giản nhưng lại có tác động rất lớn đến độ tái lập của kết quả. Các chuyên gia cũng nhấn mạnh rằng khả năng lặp lại của một thí nghiệm phụ thuộc vào việc kiểm soát toàn bộ điều kiện thực nghiệm chứ không chỉ dựa trên protocol.

Kết luận và khuyến nghị hành động

Một protocol chuẩn là điều kiện cần, nhưng chưa phải điều kiện đủ để tạo ra kết quả nuôi cấy tế bào ổn định. Những yếu tố như Lot-to-Lot Variation, chất lượng môi trường nuôi cấy, passage của tế bào, điều kiện tủ ấm và kiểm soát nhiễm tạp đều có thể tạo ra khác biệt đáng kể giữa các lần thí nghiệm.

Vì vậy, nếu muốn nâng cao độ tin cậy của dữ liệu, kết quả nuôi cấy các đơn vị không chỉ cần chuẩn hóa quy trình thao tác mà còn phải xây dựng hệ thống quản lý vật tư, theo dõi số lot và lựa chọn các sản phẩm đã được kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt. Đối với những ứng dụng đã có môi trường xác định hóa học phù hợp, việc chuyển đổi sang serum-free hoặc chemically defined media có thể giúp giảm đáng kể biến thiên giữa các lô và cải thiện tính tái lập của kết quả.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. ATCC – Animal Cell Culture Guide https://www.atcc.org/resources/culture-guides/animal-cell-culture-guide?
2. Chen, S., Zhang, L., Ren, Y. et al. Clinical translational research on stem cell products: prospects and challenges. Sig Transduct Target Ther 11, 178 (2026). https://doi.org/10.1038/s41392-026-02582-y
3. Lebedev, T., Mikheeva, A., Gasca, V., Spirin, P., & Prassolov, V. (2025). Systematic Comparison of FBS and Medium Variation Effect on Key Cellular Processes Using Morphological Profiling. Cells, 14(5), 336. https://doi.org/10.3390/cells14050336
4. Pavlacky, J., & Polak, J. (2020). Technical Feasibility and Physiological Relevance of Hypoxic Cell Culture Models. Frontiers in endocrinology, 11, 57. https://doi.org/10.3389/fendo.2020.00057
5. https://nc3rs.org.uk/3rs-resource-library/improving-human-relevance-cell-culture-using-animal-free-culture-media
6. https://cellculturecompany.com/serum-free-cell-culture-media-benefits-challenges-and-how-to-make-the-switch/
7. Weiskirchen, S., Schröder, S. K., Buhl, E. M., & Weiskirchen, R. (2023). A Beginner’s Guide to Cell Culture: Practical Advice for Preventing Needless Problems. Cells, 12(5), 682. https://doi.org/10.3390/cells12050682