Máu có thể được xử lý theo nhiều cách khác nhau để thu được các tế bào phân lập, sau đó có thể được sử dụng trực tiếp trong các xét nghiệm sinh học hoặc được xử lý thêm để phân lập các nhóm tế bào mong muốn.

Máu toàn phần bao gồm huyết tương, các tế bào hồng cầu (RBCs hoặc erythrocytes), tiểu cầu và các tế bào bạch cầu có nhân, còn được gọi là bạch cầu (leukocytes). Các tế bào bạch cầu có thể được phân loại thêm thành các tế bào đơn nhân (mononuclear cells) và tế bào đa nhân trung tính - polymorphonuclear cells (hoặc bạch cầu hạt - granulocytes). Ở đây chúng tôi trình bày các kỹ thuật khác nhau để thu được các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC), tế bào đa nhân trung tính, bạch cầu, hoặc các tập hợp con tế bào cụ thể.

Loại bỏ tế bào hồng cầu

Việc phân tách các loại tế bào cụ thể cho các nghiên cứu cụ thể hoặc các xét nghiệm (downstream assays) có thể yêu cầu sự loại bỏ bớt hồng cầu trong bước chuẩn bị tế bào. Có một số cách để làm giảm lượng hồng cầu, bao gồm:

• Ly giải hồng cầu bằng ammonium chloride

• Làm lắng hồng cầu bằng Dextran hoặc HetaSep™
• Phân tách tế bào từ tính miễn dịch (ví dụ: chất làm suy giảm hồng cầu EasySep™)
• Dung dịch ly giải Hypotonic.

Sau khi quá trình làm giảm hồng cầu hoàn tất, mẫu thu được sẽ chứa tất cả các tế bào bạch cầu có nhân (leukocytes) có thể được sử dụng cho các xét nghiệm (downstream assays) hoặc được xử lý thêm để phân tách nhóm tế bào cần quan tâm.

Chuẩn bị tế bào đơn nhân máu ngoại vi (Peripheral Blood Mononuclear Cells - PBMC)

PBMC bao gồm tế bào lympho (tức là tế bào T, tế bào B và tế bào NK), bạch cầu đơn nhân và tế bào đuôi gai, và được định nghĩa là tế bào bạch cầu có nhân tròn. Chuẩn bị PBMC từ máu toàn phần là một bước khá phổ biến trước khi phân lập các tập hợp con tế bào miễn dịch cụ thể. Phương pháp phân tách PBMC phổ biến nhất hiện nay là sử dụng môi trường gradient mật độ (ví dụ: Ficoll™ hoặc Lymphoprep™) và ly tâm. Phương pháp này tận dụng sự khác biệt về mật độ giữa các tế bào trong máu và môi trường gradient mật độ.

Trước tiên, máu toàn phần được pha loãng với nước muối đệm phosphate (PBS) và sau đó được phân lớp trong môi trường gradient mật độ. Trong quá trình ly tâm, các tế bào có mật độ cao hơn (tức là bạch cầu hạt và hồng cầu) lắng xuống qua môi trường gradient mật độ. PBMCs lắng đọng tại mặt phân cách giữa môi trường gradient mật độ và huyết tương, từ đó chúng có thể được thu thập cẩn thận.

Tip: Mặc dù phương pháp này có thể tốn thời gian, đặc biệt là khi làm việc với số lượng mẫu nhiều, nhưng nó có thể được tăng tốc đáng kể bằng cách sử dụng các ống SepMate™.

PBMC cũng có thể được phân tách miễn dịch (immunomagnetically isolated) trực tiếp từ máu mà không cần ly tâm hoặc ly giải bằng cách sử dụng Bộ kit EasySep™. Phương pháp phân tách nhanh này tạo ra các PBMC tinh khiết chỉ trong vòng 20 phút và hoạt động trên máu toàn phần, máu cuống rốn, tủy xương, buffy coats và các sản phẩm gạn bạch cầu (leukapheresis).

Sau khi có được PBMC, phân tách tế bào từ tính miễn dịch và các kỹ thuật phân tách tế bào khác có thể được sử dụng để phân tách các tập hợp con tế bào cụ thể.

Chuẩn bị tế bào đa nhân trung tính trong máu ngoại vi (Peripheral Blood Polymorphonuclear Cells)

Tế bào đa nhân trung tính, còn được gọi là bạch cầu hạt, gồm các tập hợp con tế bào miễn dịch với các hạt chứa enzym có thể được giải phóng khi tế bào hoạt hóa. Để có được một quần thể tế bào đa nhân trung tính từ máu toàn phần, bạn có thể thực hiện bất kỳ cách nào sau đây:

• Thực hiện ly tâm gradient mật độ, sau đó là ly giải ammonium chloride. Sau đó, bạn có thể phân tách các tế bào bạch cầu hạt cụ thể như bạch cầu hạt trung tính (neutrophils), bạch cầu ưa kiềm (basophils) hoặc bạch cầu ưa acid (eosinophils) sử dụng kỹ thuật tách tế bào từ tính miễn dịch.

• Trực tiếp phân tách bạch cầu hạt từ máu, không cần ly giải hoặc ly tâm mật độ, bằng cách sử dụng kỹ thuật phân tách tế bào với EasySep™. Cách tiếp cận này cho phép bạn nhanh chóng và dễ dàng thu được bạch cầu hạt dạng chảo (pan-granulocytes) hoặc một trong những tập hợp con bạch cầu hạt cụ thể hơn (ví dụ: neutrophils, basophils, or eosinophils).

Chuẩn bị Buffy coats

Lớp buffy coats là một hỗn hợp cô đặc của bạch cầu và là kết quả khi hồng cầu và huyết tương được tách ra khỏi phần bạch cầu bằng cách ly tâm tốc độ thấp.

Quy trình này cho phép bạn có được lượng tế bào cần thiết trong khi thể tích mẫu lớn và loại bỏ các yếu tố huyết thanh hòa tan dành riêng cho người hiến tặng, giúp giảm sự biến đổi của người hiến tặng. Một lớp buffy coats có thể được chuẩn bị từ máu toàn phần hoặc tủy xương và có thể được sử dụng làm mẫu ban đầu để phân tách các quần thể tế bào cụ thể bằng cách sử dụng kỹ thuật tách tế bào từ tính miễn dịch như EasySep™.

Phân tách trực tiếp các tập hợp con tế bào cụ thể khỏi máu toàn phần

Một số kỹ thuật tách tế bào (ví dụ: EasySep™ Direct và RosetteSep™) cho phép bạn tách các tập hợp con tế bào cụ thể trực tiếp từ máu toàn phần mà không cần phải phân lập PBMC trước.

Tách tế bào khỏi các sản phẩm gạn tế bào (Apheresis Products)

Apheresis là một quá trình trong đó máu toàn phần được lấy từ một cá nhân, tách thành các thành phần và được tái sử dụng trở lại vào cá thể đó với một thành phần nhất định (ví dụ: huyết tương, tiểu cầu hoặc bạch cầu) bị loại bỏ.

Leukapheresis là một hình thức gạn tách trong đó bạch cầu được thu thập từ máu tuần hoàn của người hiến tặng. Leukopaks, là các sản phẩm bạch cầu đã được làm giàu có chứa nồng độ bạch cầu trên mỗi thể tích cao hơn so với máu toàn phần hoặc buffy coats, là nguồn tế bào đơn nhân khởi đầu lý tưởng có thể được sử dụng để phân lập tế bào miễn dịch. Tùy thuộc vào phương pháp bạn chọn, bạn có thể chuẩn bị một Leukopak để tách tế bào bằng cách cô lập phần PBMC từ nó hoặc chỉ đơn giản là làm suy giảm RBC trước khi phân lập tế bào.

Plateletpheresis là một dạng khác của quá trình gạn tách trong đó các tế bào tiểu cầu được tách ra khỏi phần còn lại của máu. Quá trình này có thể bao gồm bước giảm bạch cầu để loại bỏ bạch cầu khỏi phân đoạn tiểu cầu.

Phân tách tế bào khỏi máu cuống rốn

Máu cuống rốn có thể được lấy từ nhau thai và cuống rốn sau khi sinh. Các tế bào miễn dịch được tìm thấy trong máu cuống rốn có thể được phân tách để nghiên cứu các phản ứng miễn dịch đầu đời. Để phân tách các tế bào cụ thể từ máu cuống rốn, trước tiên bạn có thể chuẩn bị các tế bào đơn nhân bằng cách sử dụng môi trường gradient mật độ (ví dụ: Lymphoprep™) và ly tâm, hoặc bạn có thể chỉ cần làm suy giảm các tế bào hồng cầu.

Việc làm suy giảm các tế bào hổng cầu từ máu cuống rốn cần phải đặc biệt xem xét. Quá trình ly giải tiêu chuẩn ammonium chloride có thể quá khắc nghiệt đối với các tế bào tiền thân tạo máu hoặc tế bào tiền than miễn dịch có trong máu cuống rốn. Các phương pháp thay thế để loại bỏ hồng cầu có thể phù hợp hơn để loại bỏ hồng cầu khỏi nguồn mẫu này (ví dụ: EasySep™, ErythroClear™, HetaSep™).

Một yếu tố khác cần lưu ý là máu cuống rốn có thể có số lượng tiểu cầu rất cao, điều này có thể tạo điều kiện hình thành cục máu đông. Điều quan trọng là sử dụng thuốc chống đông máu thích hợp, như axit citrate dextrose (ACD) hoặc EDTA, và tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất liên quan đến máu cuống rốn khi xử lý mẫu.

(Nguồn tài liệu: Công ty STEMCELL Technologies - Canada)